Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности
Summary
Здесь мы представляем протокол следующего поколения последовательности для 16S рРНК последовательности, которая дает возможность идентификации и характеризации микробных сообществ в рамках векторов. Этот метод включает извлечения ДНК, усиления и штриховое кодирование образцов через PCR, виртуализации на поток клеток и биоинформатики соответствует последовательности данных в филогенетических информации.
Abstract
В последние десятилетия трансмиссивных заболеваний вновь возникли и расширена с угрожающей скоростью, вызывая значительные заболеваемости и смертности во всем мире. Для большинства этих заболеваний, что обусловливает необходимость разработки стратегий смягчения последствий новых болезней отсутствуют эффективные и широко доступны вакцины. С этой целью перспективным направлением контроля заболеваний включает в себя ориентации вектора микрофлора, сообщества микробов, обитающих вектор. Вектор микрофлора играет ключевую роль в динамике патогена, и манипуляции микрофлора, привели к сокращению вектор изобилия или патогена передачи для горстки трансмиссивных заболеваний. Однако переводя эти выводы в болезни управления приложения требует глубокого понимания вектор микробной экологии, исторически ограничивается недостаточным технологии в этой области. С появлением следующего поколения последовательности подходов позволила быстрый, высоко параллельной последовательности различных микробных сообществ. Ориентация весьма сохраняется 16S рРНК гена способствовала характеристики микробов присутствует в векторы в различных экологических и экспериментальных условиях. Этот метод включает амплификацию гена 16S рРНК, штриховое кодирование образца через PCR, Загрузка образцов на ячейку потока для виртуализации, и биоинформатики подходов к последовательности данные сопоставить с филогенетической информации. Видов или род уровень идентификации для большого числа реплицирует обычно может быть достигнуто через этот подход, таким образом обходя проблемы низкой обнаружения, резолюции и вывода из традиционного культивирования, микроскопии или гистологических пятнать методы. Таким образом этот метод хорошо подходит для характеризующие вектор микробов в различных условиях, но в настоящее время не может предоставлять информацию о микробной функции, расположение внутри Вектор, или ответ на лечение антибиотиками. В целом 16S секвенирование нового поколения – это мощный метод для лучшего понимания личности и роли векторных микробов в динамике болезни.
Introduction
Возрождение и распространение трансмиссивных заболеваний в последние десятилетия представляют серьезную угрозу для глобального здоровья человека и дикой природы. Для большинства этих заболеваний отсутствуют эффективные вакцины, и усилия управления препятствуют сложные биологической природы векторов и вектор хост взаимодействий. Понимание роли микробных взаимодействий внутри вектор в передаче возбудителя может позволить для разработки новых стратегий, позволяющих обойти эти проблемы. В частности взаимодействия между связанный вектор Комменсалами микроорганизмов, симбионтами и патогенов, именуемый микрофлора, могут иметь важные последствия для передачи возбудителя. Подавляющее большинство доказательств теперь поддерживает это утверждение, с примерами, демонстрируя связь между вектор микрофлора и компетентности для таких заболеваний, как малярия, вирус Зика и болезни Лайма1,2,3. Однако переводя эти выводы в стратегии по контролю за заболеваниями требует гораздо более глубокое понимание структуры, функции и происхождение векторных microbiomes. Определение и характеристика вектор микробной сообщества в различных экологических и экспериментальных условиях составляют важный путь вперед в этой области.
Процедуры выявления микробной жители возбудителя вектора предоставляется здесь, используя западные черный legged клеща, Ixodes pacificus, вектор, видов возбудителя болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Хотя клещей гавани больше типов патогенов человека, чем любых других членистоногих, относительно мало известно о биологии и сообщество экологии тик microbiomes4. Очевидно, что клещи гавани разнообразных вирусов, бактерий, грибков и простейших, которые включают Комменсалами, endosymbionts и переходные микробной жителей5,4. Предыдущие работы продемонстрировал сильные колебания Ixodes microbiomes, связанные с география, видов, секс, стадия жизни и крови еды источник6,,78. Однако механизмы, лежащие в основе этого различия остаются неизвестными и гарантируете, что более подробные расследования происхождения и Ассамблеи этих микробных сообществ. Клещи могут приобрести микробов путем вертикальной передачи, контакт с хостов и поглощение из окружающей среды через дыхальца, рот и анальный поры9. Понимание факторов, определяющих первоначального формирования и развития клеща микрофлора, специально относительный вклад вертикальных и окружающей среды передачи, имеет важное значение для понимания физических моделей и вариации в тик микрофлора разнообразие и как эти общины взаимодействуют во время передачи возбудителя, с возможным приложениями для управления заболеванием или вектор.
Мощные молекулярные методы, такие как секвенирование нового поколения, теперь для выявления микробных сообществ существуют и могут быть использованы характеризовать вектор microbiomes в различных условиях окружающей среды или экспериментальных. До появления этих подходов высокопроизводительного секвенирования выявление микробов полагались преимущественно на микроскопии и культуры. В то время как микроскопии — это быстрый и простой метод, Морфологические методы для идентификации микробов по своей сути субъективный и грубый и ограничивается низкой чувствительностью и обнаружения10. Методы на основе культуры широко используются для идентификации микроорганизмов и может использоваться для определения чувствительности микробов к наркотиков лечения11. Однако этот метод также страдает от низкой чувствительностью, как было подсчитано, что меньше, чем 2% экологических микробов может культивировали в лаборатории, установив12. Гистологические окрашивание подходы также были использованы для обнаружения и локализации конкретных микробов в векторы, включить расследования различных дистрибутивов таксонов в пределах клеща и исследование гипотезы о микробных взаимодействий. Однако предварительное знание микробного идентификации необходим для выбора соответствующего пятна, что делает этот подход плохо подходит для микробиологических характеристик и идентификации. Кроме того гистологические пятнать это очень много времени, трудоемкий процесс и не подходит для больших выборок. Традиционные Молекулярные подходы например Сэнгер, секвенирование аналогичным образом ограничены в их чувствительность и обнаружения различных микробных сообществ.
Секвенирование нового поколения позволяет для быстрой идентификации микробов из большого числа проб. Наличие стандартных маркерных генов и справочных баз данных дальнейшем позволяет повысить таксономических резолюции, часто до уровня рода или вида. Для достижения этой цели, с 16S рРНК чаще связано с наличием сохраняемой и переменных регионов в рамках гена, что позволяет для создания универсальных грунты с уникальными ампликонов для каждого бактериального часто используются малые Субблок рибосомной РНК виды,1314. В настоящем докладе подробно процедуру для определения таксонов в тик микрофлора через 16S рРНК секвенирование нового поколения. В частности этот протокол подчеркивает шаги, необходимые для подготовки образцов для виртуализации. Более обобщенные сведения о виртуализации и биоинформатики шаги предоставляются, как есть множество виртуализации платформ и программ анализа имеющихся в настоящее время, каждый с обширной существующей документации. Общая осуществимости этого подхода секвенирование нового поколения продемонстрировал, применяя его к расследованию микробных Ассамблеи в рамках ключевых болезнь векторного.
Protocol
Representative Results
Discussion
Секвенирование нового поколения 16S рРНК стал стандартным подходом для микробного идентификации и включено изучение как вектор microbiomes влияют на передачи возбудителя. Протокол, изложенные здесь подробности использования этого метода расследовать микробных Ассамблеи в I. pacificus, век?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд предоставляет а.с. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
