Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

요약

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

초록

단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.

서론

Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서^1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리^{1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10....}

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비

1. 플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리
   1. PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화^21,22젤.
   2. fluorospectrometer을 사용 하 여 파편의 농도 측정 합니다. 백본 1에서 securin 및 mCherry 삽입과의 결합 100 ng: 1:1 분자 비율 5 µ L에 대 한 반응의 총 볼륨 조절 이온된 수를 추가 하 고.
   3. 1의 3 mL와 함께 등온 어셈블리 반응 버퍼 x 5의 6 mL 준비 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 M MgCl₂, 600 10 mM dNTP의 µ L, 1 M DTT의 300 µ L, 페그-8000, 1.5 g 및 나드^2....

결과

그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/c. 홍보 anaphase의 기판은 securin Anaphase 동안 securin mCherry의 저하는 따라서 APC/c.의 활동을 나타냅니다.

다운스트림 mitotic 이벤트를 mitotic 발진기의 능력 검사, 우리 또한 공급 demembranated 정자 염색 질.......

토론

우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironments에서 추출 물 캡슐은 진동 활동을 유지 하기 위해 중요 합니다. 얇은 튜브 굴레 쉽게 이미지 프로세싱 및 장기 추적을 위한 단일 레이어 내에서 물방울에 기름 방울의 세 번째, 보육 넷째, 낮은 표면 에너지를 반대로 접착제로 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란과 튜브 내벽을 코팅 추출 활동을 유지 도움이 됩니다. 다섯째, 오일 튜브 씰링 방울 흐름을 방지할 것. 오일 밀봉 방법 또한 증발을 방지 하 고 더 추출 활동을 보존 수 있습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Xenopus laevis 개구리	Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit	QIAGEN	27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)	QIAGEN	28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell	Sigma-Aldrich	B2935
칼슘 이오노포어	Sigma-Aldrich	A23187
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	독성
트리클로로	시그마-알드리치	448931	독성
(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸) 실란
PFPE-PEG 계면활성제	란 생명공학	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE 헬스케어 글루타티온 세파로스 4B 비드	시그마-알드리치	GE17-0756-01
PD-10 열	Sigma-Aldrich	GE17-0851-01
VitroCom 소형 중공 유리관	VitroCom	5012
올림푸스 SZ61 스테레오 현미경	올림푸스 올림푸
IX83 현미경	올림푸스 올림푸
FV1200 컨포칼 현미경	올림푸스
NanoDrop 분광 광도계	Thermofisher	ND-2000
0.4 mL 스냅 캡 마이크로튜브	E& K Scientific	485050-B
PureLink RNA 미니 키트	ThermoFisher(Ambion)	12183018A
Fisherbrand 아날로그 와류 믹서	Fisher Scientific	2215365
Imaris	Bitplane	버전 7.3	이미지 분석 소프트웨어

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