アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして
Summary
アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ ウイルス複製を取得する研究者を許可します。
Abstract
RNA 干渉とゲノム編集ベースのスクリーニングのプラットフォームは、ウイルスの複製を制限する宿主細胞因子を識別するために広く使用されています。ただし、これらの画面は自然寛容な検討中のウイルスの病原体が細胞で普通行なわれます。したがって、制御条件下でウイルスの堅牢なレプリケーションはこれらの画面のダイナミック レンジを制限があります。さらに、これらの画面はウイルスがホストによく適応し、抗ウイルス防御に対抗できる場合にウイルスの複製を制限する細胞防御経路を簡単に識別することができないがあります。この記事では当然中止になる感染症の水疱性口内炎ウイルス (VSV) などアルボ ウイルスによるセンター スクリーンを使用してウイルス-宿主間相互作用を探索するための新しいパラダイムをについて説明します。双翅目昆虫と哺乳類のホストの広い範囲で複製 VSV の能力、にもかかわらず VSV はマイマイガ (強マイマイガ) などの鱗翅目昆虫由来細胞株の様々 なポスト エントリ、感染を受けます。しかし、これらの失敗に終わった VSV の感染症救えることができる””ホスト細胞の抗ウイルス防御が危害を受けたとき。便利なレポーター遺伝子と制限・ l ・区の VSV の株について述べるセルラインはアルボ ウイルスの制限に関与する宿主因子を識別するためにセットアップ画面に組み合わせることができます。さらに、VSV レプリケーション重感染中または哺乳類のウイルスによってエンコードされているを含む異所性の表現を救出するバイラル エンコードされた因子の同定にこれらのスクリーニング ツールの有用性をまた示します。L. 区細胞の複製 VSV 自然の制限を監視する単純な発光と蛍光ベースの試金の使用ができ、VSV 救助を促進する条件のスクリーニング時高い信号対雑音比を提供しますVSV レプリケーションに変更。これらの方法は、応答したホストとウイルスの免疫回避要因間の相互作用を理解するため貴重です。
Introduction
生産的、特定のホストに複製するウイルスの機能は、一部ウイルス エントリおよびレプリケーション1をサポートする宿主細胞因子の可用性によって決まります。ウイルス-宿主範囲は、カウンター細胞の抗ウイルス防御ウイルス複製2,3妨げになるそれ以外の場合にウイルスの容量によっても決定することができます。それは最終的にウイルスが特定のホストにそのライフ サイクルを完了できるかどうかを決めるこれらの複雑なウイルス-宿主相互作用の結果です。ウイルス複製のすさまじいホストの可能性がある病原性の結果を与えられて、それは失敗に終わったと生産性のバランスをひっくり返すかもしれないキー ウイルス-宿主間の相互作用の理解を深める実験的戦略を開発する重要です感染症。ウイルス-宿主相互作用の分子の機能を解明新しいと代替の抗ウイルス治療戦略の開発に尽力されます。
RNA 干渉 (RNAi)4,の出現で5とゲノム編集ツール (e.g、CRISPR Cas9、亜鉛指 TALENs 核酸分解酵素)6、7、が可能になりつつ実験を変更する、。ゲノムの細胞因子の発現は拡張し、ウイルスの複製におけるこれらの変化の影響を探索します。確かに、多数の RNAi とゲノム編集による画面のウイルス-宿主間相互作用8,9,10、の新たな側面を明らかにした無脊椎動物と脊椎動物のホスト細胞の種類で行われています。11,12. これらの画面は、通常ウイルス記者、ホタルのルシフェラーゼ (リュック) や蛍光タンパクなどをエンコードを採用 (e.g、GFP、下流)、読み出しとしてウイルス遺伝子発現を定量的に評価するの便利な手段を提供する。ウイルスの複製9,12。この方法により、いずれかを促進するまたはそれぞれ増加または減少、によって証明されるウイルスの複製の反感を買う、ウイルス記者信号9,12ホスト因子を特定する研究者です。ただし、ほとんどの場合で、これらの画面はよく検討されているホスト セルの種類に適応しているウイルスを使用して行われています。この戦略は、ウイルスの病原体の自然宿主と共進化の関係を理解するために重要なことができますが、それは暴く宿主の抗ウイルス因子の使用に関する基本的な懸念を提起します。これらのケースでウイルス記者の向上は RNAi ノックダウンが捜されているまたは通常ウイルスの複製を妨げる細胞因子の不活化に信号を送る。まず、ウイルスがロバスト制御条件下で検討されている宿主細胞で複製することが既にいる場合画面 (すなわち背景と強化されたウイルス記者信号を区別する能力) のダイナミック レンジが制限あります。第二に、この問題はウイルスが宿主細胞によく適応し、画面でターゲットにされているホストの防衛の経路に対抗するに有効である状況によってさらに悪化します。
伝統的なウイルス-宿主相互作用スクリーニング法に関する上記の懸念のため、鱗翅目の昆虫細胞で当然のことながら失敗に終わったアルボ ウイルス感染を悪用するウイルス-宿主間の相互作用を研究するための新たなパラダイムを開発しました。この戦略は、よく研究人間アルボ、VSV がマイマイガ (L. マイマイガ)13由来細胞で失敗に終わった感染を受ける観察から派生します。VSV は自然哺乳類を宿主に双翅目昆虫 (すなわちチョウバエ) によって送信し、の脊椎動物のホスト細胞文化とin vivo14無脊椎動物の広い範囲に感染するのに実験的に示されています。VSV の 11 kb 負意味一本鎖 RNA ゲノムそれぞれはエンベロープ ウイルス粒子を構成するタンパク質に翻訳される 5 つのサブゲノム Mrna をエンコードします。ただし、VSV 逆遺伝系リュックまたは 5 自然 VSV 遺伝子製品15,16,17に加えて、蛍光タンパク質をエンコード レプリケーション主務系統の作成許可されています。これらのレポーター蛋白質は VSV virion に組み込まれません、VSV 遺伝子発現後のエントリに発生する便利な読み出しを実現できます。VSV 系統 GFP などリュックのエンコーディングを使用して、我々 は以前に VSV 遺伝子発現は LD652 セルのエントリ時に厳しく制限されることと、VSV 抗体は感染後 72 時間 (hpi) で増やさない。対照的に、VSV と哺乳類のポックス ウイルス、ワクシニア ウイルス (VACV)、LD652 細胞の重感染は、この時点で VSV 遺伝子発現と抗体の対数の向上につながります。VACV を受ける初期遺伝子発現、DNA 複製と LD652 細胞感染後期遺伝子発現 VACV レプリケーション サイクルが不完全なウイルス粒子の形態形成18のため最終的に失敗に終わった。~ 192 kb DNA ゲノム VACV の多くはホストの免疫反応の19の抑制することによってウイルスの複製を促進する免疫調節プロパティを表示 > 200 タンパク質をエンコードします。したがって、我々 は VACV 重感染による LD652 細胞の複製 VSV「レスキュー」だった通常 VSV の複製を制限するL. 区応答を抑制する免疫調整物質 VACV を介した可能性が高いことを仮定しました。この、サポート ホスト RNA ポリメラーゼ II 阻害剤アクチノマイシン D LD652 細胞の治療はまた VSV レプリケーション LD652 細胞における転写非依存性ホスト応答ブロック VSV レプリケーション後エントリ13のことを示すを救助します。
上記の示唆、LD652 細胞の VSV 感染への当然のことながら制限的な性質があります比較的低バック グラウンド レポーターの VSV でエンコードされた信号 (すなわちホストを阻害するものを強化する条件のスクリーニング抗ウイルス防御)。ここでは、鱗翅目昆虫細胞で VSV 制限を緩和条件の蛍光または画面にリュックに基づく試金を使用するための方法を提供します。まず、これらの試金を使用して破る VSV 制限いずれかの重感染実験中または候補ウイルス因子の異所性発現によってエンコードされたウイルスの免疫調節因子を特定する方法を示します。例として、我々 は我々 は救助その他のポックス ウイルスの要因13の不在で VSV レプリケーション免疫調節因子の新しい家族の一員として A51R のポックス ウイルス符号化された蛋白質を識別するためにこれらのスクリーニング技術を使用する方法を示します。第二に、RNAi 制限 VSV LD652 細胞感染のスクリーニングを使用して直接アルボ制限13真核生物の宿主因子を特定する方法を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで制限の鱗翅目昆虫の細胞培養で VSV レプリケーションを救出条件画面に蛍光・発光ベースのシンプルなアッセイを説明しました。鱗翅目昆虫細胞で VSV の不成功の伝染は、VSV 遺伝子発現のための試金と優れた信号対雑音比を作成します。たとえば、単一の VSV リュック感染から溶解液で検出される LU 信号があった 〜 1,000 倍以上のモック感染 lysates まだこれらの信号のみ 72 h 経過で約 2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
総局は、テキサス大学南西医療センターの恵まれている学者プログラムからの資金によって支えられました。著者は VSV した DsRed の VSV リュック提供ありがとうマイケル Whitt (テネシー大学保健科学センター) とショーン ・ ウィーラン (ハーバード大学医学部)。著者はまた、VACV FL GFP ひずみの種類のギフトのゲイリー Luker (ミシガン大学医学部) を感謝します。
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
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