Arbovirus infeksjoner som Screening verktøy for identifikasjon av Viral Immunomodulators og vert Antiviral faktorer
Summary
Her presenterer vi protokoller for å identifisere 1) virus-kodede immunomodulators som fremmer arbovirus replikering og 2) eukaryote vert faktorer som begrenser arbovirus replikering. Metodene fluorescens og luminescence-baserte tillate forskere å raskt få kvantitative readouts arbovirus replikasjon i enkle analyser med lav signal-til-støy-forhold.
Abstract
RNA forstyrrelser- og genom redigering-basert screening plattformer har vært mye brukt til å identifisere verten celle faktorer som begrenser virus replikering. Disse skjermene er imidlertid vanligvis gjennomført i celler som er naturlig ettergivende til viral patogen under studien. Derfor kan robust replikering av virus kontroll forhold begrense det dynamiske utvalget av disse skjermene. Videre kan disse skjermene kanskje ikke å lett identifisere cellulære forsvar trasé som begrenser virus replikering hvis viruset er godt tilpasset til verten og i stand til å møte antiviral forsvar. I denne artikkelen beskriver vi et nytt paradigme for å utforske virus vert interaksjoner ved hjelp av skjermer som senter på naturlig mislykket infeksjoner med arboviruses som vesicular stomatitt virus (VSV). Til tross for muligheten for VSV å gjenskape i en rekke dipteran insekter og pattedyr verter, gjennomgår VSV en mislykket, etter oppføring infeksjon i en rekke cellelinjer avledet fra Lepidoptera insekter, som sigøyner møll (Lymantria dispar). Men kan disse mislykket VSV infeksjoner være “reddet” når verten celle antiviral forsvar er kompromittert. Beskriver vi hvordan VSV påkjenningen koding praktisk reporter gener og restriktiv L. dispar linjer kan kobles til oppsett skjermer å identifisere vert faktorer involvert i arbovirus begrensning. Videre, vi også vise nytten av disse screening verktøy i identifikasjon av virally kodet faktorer som redde VSV replikering under coinfection eller gjennom ektopisk uttrykk, inkludert de kodet av pattedyr virus. Naturlige begrensning VSV replikering i L. dispar celler gir høy signal-til-støy forholdet når screening for forhold som fremmer VSV redning, dermed muliggjør bruk av forenklede luminescence – og fluorescens-baserte analyser overvåke endringene i VSV replikering. Disse metodene er nyttige for å forstå samspillet mellom verten antiviral svar og viral immun evasion faktorer.
Introduction
Muligheten for et virus å gjenskape produktivt i en bestemt vert er delvis styrt av tilgjengeligheten av verten celle faktorer som støtter viral oppføringen og replikering1. Virus-vert området kan også være diktert av kapasiteten på virus til counter mobilnettet antiviral forsvar som ellers ville hindre viral replikasjon2,3. Det er resultatet av disse komplekse virus vert interaksjoner som til slutt avgjør om virus vil kunne fullføre livssyklusen i en bestemt vert. Gitt potensielt patogene konsekvensene for verten hvis viral replikasjon oppstår, er det avgjørende å utvikle eksperimentelle strategier for å fremme vår forståelse av viktige virus vert interaksjoner som kanskje tips balansen mellom mislykket og produktiv infeksjoner. Klargjørende molekylær funksjonene av virus-vert interplay vil være medvirkende i utviklingen av nye og alternative antiviral strategier.
Med ankomsten av RNA forstyrrelser (RNAi)4,5 og genomet-redigeringsverktøy (f.eks., CRISPR-Cas9, sink finger nucleases, TALENs)6,7, det har blitt eksperimentelt mulig å endre det uttrykk for cellulære faktorer på genomet-bred skalerer og utforske effekten av disse endringene på virus replikering. Faktisk, mange RNAi og genomet-redigering-baserte skjermer er utført i virvelløse og virveldyr vert celletyper som har avsløre nye fasetter av virus-vert interaksjoner8,9,10, 11 , 12. disse skjermene vanligvis benytter virus koding journalister, som firefly luciferase (LUC) eller fluorescerende proteiner (f.eks., GFP, DsRed), som gir praktisk måte kvantitativt vurdere viral genuttrykk som en avlesning for viral replikasjon9,12. Denne strategien kan forskerne identifisere vert faktorer som enten fremme eller antagonize viral replikasjon som gjenspeiles av øker eller reduseres, henholdsvis, i viral reporter signaler9,12. Imidlertid i de aller fleste tilfeller, har disse skjermene vært gjennomført med virus som er godt tilpasset til verten celle type der de blir undersøkt. Mens denne strategien kan være viktig for å forstå coevolutionary relasjoner mellom viral patogener og deres naturlige verter, utgjør det grunnleggende bekymringer angående bruken avdekke vert antiviral faktorer. I slike tilfeller en forbedring i virus reporter signalet på RNAi knockdown blir sett for eller inaktivering av en mobilnettet faktor som vanligvis hindrer viral replikasjon. Først, hvis et virus er allerede kunne robust gjenskape i vert cellen undersøkt under kontroll forhold, det dynamiske området av skjermen (dvs., muligheten til å skille mellom bakgrunn og forbedret viral reporter signaler) kan være begrenset. Det andre er problemet ytterligere forverret av situasjoner der viruset er godt tilpasset til verten cellen og effektiv på å bekjempe vert forsvar trasé som er målrettet i skjermen.
På grunn av de over bekymringene om tradisjonelle virus vert samhandling screening metoder, utviklet vi et nytt paradigme for å studere viruset vert interaksjoner som utnytte naturlig mislykket arbovirus infeksjoner i Lepidoptera insekt celler. Denne strategien kommer fra en observasjon at det godt studert menneskelige arbovirus, VSV, gjennomgår en mislykket infeksjon i cellene stammer fra den sigøyner møll (L. dispar)13. VSV overføres naturlig av dipteran insekter (dvs., sand fluer) til pattedyr verter, og har vist eksperimentelt å infisere et bredt spekter av virvelløse dyr og virveldyr verter både i celle kultur og i vivo14. 11-kb negative-sense single-strandet RNA genomet av VSV koder fem subgenomic mRNAs som hver er oversatt til proteiner som utgjør den omsluttede virion. Imidlertid har VSV omvendt genetiske systemer tillatt for opprettelse av replication kompetente stammer koding LUC eller fluorescerende proteiner, i tillegg til fem naturlige VSV genet produkter15,16,17. Fordi disse reporter proteiner ikke er innlemmet i VSV virion, gir de en praktisk avlesning for VSV genuttrykk som oppstår etter oppføring. Bruker VSV stammer koding GFP eller LUC, har vi tidligere vist at VSV genuttrykk er sterkt begrenset ved oppføring av LD652 celler og at VSV titers ikke økning av 72 timer etter infeksjon (hpi). Derimot fører coinfection av LD652 celler med VSV og pattedyr poxvirus, vaccinia virus (VACV), til logaritmisk øker både VSV genuttrykk og titers av dette tidspunkt. VACV gjennomgår tidlig genuttrykk utryddelse og sent genuttrykk i LD652 celle infeksjoner, men VACV replikering syklusen er slutt mislykket på grunn av ufullstendige virion morphogenesis18. Store ~ 192-kb DNA genomet av VACV koder > 200 proteiner, hvorav mange viser immunmodulerende egenskaper som fremmer viral replikasjon gjennom undertrykkelse av verten immunreaksjoner19. Derfor hypotesen vi at “redde” av VSV replikasjon i LD652 celler av VACV coinfection var sannsynlig formidlet av VACV immunomodulators som hemmet L. dispar svar vanligvis begrense VSV replikering. Dette redder behandling av LD652 celler med verten RNA polymerase II hemmer actinomycin D også VSV replikering i LD652 celler, som indikerer at transkripsjon-avhengige vert svarene blokkere VSV replikering etter oppføring13.
Over observasjoner foreslår at naturlig restriktive natur LD652 cellene VSV infeksjon kan gi en relativt lav bakgrunn når screening for forhold som forbedrer VSV-kodet reporter signaler (dvs.de som hemmer vert antivirale forsvar). Her gir vi metodene for å bruke fluorescens eller LUC-baserte analyser til skjermen for forhold som lindre VSV begrensning i Lepidoptera celler. Først viser vi hvordan disse analyser kan brukes til å identifisere virally kodet immunmodulerende faktorer som bryter VSV begrensning under enten coinfection eksperimenter eller gjennom ektopisk uttrykk for kandidaten viral faktorer. Som et eksempel viser vi hvordan vi brukt disse screening teknikker for å identifisere poxvirus-kodede A51R proteiner som en ny familie av immunmodulerende faktorer som redde VSV replikering i fravær av andre poxvirus faktorer13. Andre illustrerer vi hvordan RNAi screening i restriktiv VSV-LD652 celle infeksjoner kan brukes til å identifisere direkte eukaryote vert faktorer involvert i arbovirus begrensning13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet enkel fluorescens – og luminescence-baserte analyser til skjermen for forhold som redde VSV replikering i restriktiv Lepidoptera cellekulturer. Mislykket infeksjon av VSV i Lepidoptera celler oppretter en utmerket signal-til-støy-forhold når assaying for VSV genuttrykk. For eksempel LU signalene oppdaget i lysates fra enkelt VSV-LUC-infeksjoner ble ~ 1000 ganger høyere enn i uekte-infiserte lysates, men disse signalene bare forandret ca todelt en 72-h klokkeslett løpet. Derimot coinfection av VSV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. ble støttet av finansiering fra University of Texas Southwestern Medical Center utstyrt Scholars Program. Forfatterne takker Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) og Sean Whelan (Harvard Medical School) for levering av VSV-DsRed og VSV-LUC. Forfatterne takker også Gary Luker (University of Michigan Medical School) for type gave VACV FL GFP belastningen.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
References
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
