Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

Summary

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Abstract

RNA interference – et génome édition axée sur les plateformes de dépistage ont été couramment pour identifier les facteurs de cellule hôte qui restreignent la réplication du virus. Toutefois, ces écrans sont généralement effectuées dans des cellules qui sont naturellement permissives au pathogène viral à l’étude. Par conséquent, la réplication robuste de virus dans des conditions de contrôle peut limiter la plage dynamique de ces écrans. En outre, ces écrans peuvent être incapables d’identifier facilement les voies de défense cellulaire qui restreignent la réplication du virus si le virus est bien adapté à l’hôte et capable de lutter contre les défenses antivirales. Dans cet article, nous décrivons un nouveau paradigme pour explorer les interactions virus-hôte grâce à l’utilisation des écrans qui se centre sur les infections naturellement avortées par arbovirus tels que les virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Malgré la capacité de la VSV à reproduire dans un large éventail d’insectes diptères et hôtes mammifères, VSV subit une infection postérieure à la création avortée dans une variété de lignées cellulaires dérivées de lépidoptères, tels que la spongieuse (Lymantria dispar). Cependant, ces infections VSV avortées peuvent être « sauvées » lorsque les défenses antivirales des cellules hôte sont compromises. Nous décrivons comment VSV souches gènes codant de journaliste commode et restrictives dispar L. lignées cellulaires peuvent être couplées aux écrans de configuration afin d’identifier les facteurs de l’hôte impliqués dans restriction des arbovirus. En outre, nous montrons également l’utilité de ces outils de dépistage pour l’identification des facteurs virally codés que sauver la réplication VSV pendant la co-infection ou par le biais de l’expression ectopique, y compris celles encodées par des virus chez les mammifères. La limitation naturelle de la réplication dans les cellules de dispar L. VSV fournit un rapport signal sur bruit élevé lorsque le dépistage pour les conditions qui favorisent le sauvetage VSV, permettant ainsi l’utilisation d’épreuves simplistes luminescence et fluorescence dotés de surveiller les modifications dans la réplication de VSV. Ces méthodes sont utiles pour comprendre l’interaction entre réponses antivirales de l’hôte et des facteurs viraux évasion immunitaire.

Introduction

La capacité d’un virus de façon productive répliquer dans un hôte particulier est régie en partie par la disponibilité des facteurs de cellule hôte prenant en charge l’entrée virale et réplication¹. La gamme de virus-hôte peut aussi être dictée par la capacité d’un virus à compteur cellulaire antivirale défenses qui seraient autrement empêcher la réplication virale^2,3. Il est le fruit de ces interactions hôte-virus complexe qui décident en dernier ressort si un virus sera en mesure de terminer son cycle de vie dans un hôte particulier. Étant donné les conséquences potentiellement pathogènes pour l’hôte si la réplication virale s’ensuit, il est essentiel d’élaborer des stratégies expérimentales pour approfondir notre compréhension des interactions virus-hôte clés qui peuvent faire pencher la balance entre avortée et productif infections. Élucider les caractéristiques moléculaires de l’interaction virus-hôte jouera un rôle déterminant dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales.

Avec l’avènement de l’ARN interférence (ARNi)^4,5 et les outils de retouche du génome (e.g., CRISPR-Cas9, Zinc finger nucleases, TALENs)^6,7, il est devenu expérimentalement possible de modifier la expression des facteurs cellulaires sur tout le génome, échelles et d’analyser l’impact de ces modifications sur la réplication virale. En effet, les nombreux RNAi et génome édition dotés d’écrans ont été menées dans les types de cellule hôte d’invertébrés et de vertébrés qui ont dévoilé de nouvelles facettes de virus-hôte interactions^{8,9,10, 11 , 12}. ces écrans emploient généralement virus codant des journalistes, comme la luciférase firefly (LUC) ou protéines fluorescentes (e.g., GFP, DsRed), qui fournissent un moyen pratique d’évaluer quantitativement l’expression de gènes viraux comme une lecture pour la réplication virale^9,12. Cette stratégie permet aux chercheurs d’identifier les facteurs de l’hôte qui soit promouvoir ou antagonisent la réplication virale, comme en témoignent les augmentations ou diminutions, respectivement, en journaliste virale signaux^9,12. Toutefois, dans la grande majorité des cas, ces écrans ont été réalisées à l’aide de virus qui sont bien adaptés pour le type de cellule hôte dans lequel ils sont à l’étude. Si cette stratégie peut être importante pour la compréhension des relations coévolutive entre les virus pathogènes et leurs hôtes naturels, il pose des préoccupations fondamentales au sujet de leur utilisation en découvrant facteurs antiviraux de l’hôte. Dans ces cas, une amélioration dans la journaliste virus signal à Arni knockdown est recherchée ou à l’inactivation d’un facteur cellulaire qui normalement empêche la réplication virale. Tout d’abord, si un virus est déjà capable de se répliquer fermement dans la cellule hôte examinée dans des conditions de contrôle, la plage dynamique de l’écran (c’est-à-dire, la capacité de distinguer entre le fond et journaliste virale accrue des signaux) peut être limitée. Deuxièmement, ce problème est aggravé par les situations dans lesquelles le virus est bien adapté à la cellule hôte et efficace à la lutte contre les voies de défense hôte qui sont ciblés sur l’écran.

En raison de préoccupations ci-dessus au sujet de l’interaction virus-hôte traditionnelles méthodes de dépistage, nous avons développé un nouveau paradigme pour étudier les interactions virus-hôte qui exploitent les infections naturellement abortif arbovirus dans des cellules d’insectes lépidoptères. Cette stratégie découle d’une observation que l’arbovirus humaine bien étudiés, VSV, subit une infection avortée dans les cellules dérivées de la spongieuse (L. dispar)¹³. VSV est naturellement transmise par des insectes diptères (c.-à-d., phlébotomes) aux hôtes mammifères et il a été démontré expérimentalement pour infecter un large éventail d’invertébrés et vertébrés hôtes dans les deux cellules de culture et in vivo¹⁴. Le génome d’ARN simple brin sens négatif 11-Ko de la VSV encode les ARNm subgénomique cinq qui sont chacun traduits les protéines qui composent le virion enveloppé. Cependant, systèmes de génétique inverses VSV ont permis la création de souches aptes à la réplication encodage LUC ou protéines fluorescentes, outre les cinq VSV naturelle gène produits^15,16,17. Comme ces protéines journaliste ne sont pas incorporées dans le virion VSV, ils proposent une lecture commode pour l’expression de gène VSV qui survient après l’entrée. À l’aide de souches VSV codant la GFP ou LUC, nous avons déjà montré que l’expression des gènes VSV est strictement limitée à l’entrée des cellules LD652 et que les titres VSV n’augmentent pas par une infection après 72 heures (hpi). En revanche, la co-infection des cellules LD652 VSV et les mammifères poxvirus, virus de la vaccine (VACV), provoque une augmentation logarithmique de l’expression des gènes VSV tant des titres par ce point dans le temps. VACV subit l’expression des gènes précoces, réplication de l’ADN et la fin expression génique dans les infections de cellules LD652, mais le cycle de réplication VACV est finalement avorté en raison de virion incomplète morphogenèse¹⁸. Le grand génome d’ADN ~ 192-Ko de VACV encode les protéines > 200, dont beaucoup affichent des propriétés immunomodulatrices qui favorisent la réplication virale par la suppression de l’hôte des réponses immunitaires¹⁹. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que le « sauvetage » de la réplication dans les cellules LD652 de la co-infection VACV VSV a été probablement véhiculé par immunomodulateurs VACV qui inhibe les réponses dispar L. normalement limiter la réplication VSV. À l’appui de cela, le traitement des cellules LD652 avec l’inhibiteur de II hôte RNA polymérase actinomycine D sauve aussi réplication de la VSV dans les cellules LD652, indiquant que la transcription dépendante h6te bloque VSV réplication après l’entrée¹³.

Ces observations suggèrent que le caractère restrictif naturellement des cellules LD652 à l’infection de VSV peut fournir un fond relativement faible lorsque le dépistage pour les conditions qui améliorent les signaux codés VSV journaliste (c’est-à-direceux qui inhibent l’hôte défenses antivirales). Ici, nous fournissons les méthodes pour l’utilisation de la fluorescence ou analyses LUC à l’écran pour des conditions qui soulagent la restriction de la VSV dans des cellules chez les lépidoptères. Tout d’abord, nous montrons comment ces tests peuvent être utilisés pour identifier les facteurs immunomodulateurs virally codé qui cassent la restriction VSV au cours de deux expériences de co-infection ou par le biais de l’expression ectopique de facteurs viraux de candidat. À titre d’exemple, nous illustrons comment nous avons utilisé ces techniques de dépistage pour identifier les poxvirus codé A51R protéines comme une nouvelle famille de facteurs immunomodulateurs qui sauver réplication VSV en l’absence d’autres facteurs de poxvirus¹³. Deuxièmement, nous illustrons comment RNAi de dépistage dans les infections de cellule de VSV-LD652 restrictives peut servir à identifier directement facteurs de l’hôte eucaryote participant à arbovirus restriction¹³.

Protocol

1. GENERALITES Lymantria dispar (LD652) Culture de cellules et Virus LD652 cellule culture et placage À la culture dispar L.-dérivées des cellules LD652, maintenir une monocouche de cellules dans un milieu de culture (Table des matières) incubés à 27 ° C sous atmosphère normale. Maintenir les cellules en plats de tissu-culture-traitée de 10 cm et de passage des cellules en arrivant à confluence de 80 %. Plaque, déloger…

Representative Results

Par exemple des applications d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller le sauvetage VSV sur la co-infection VACV, LD652 cellules ont été plaqués dans un plat de lamelle de 8 puits puis infectés par le simulacre ou infectés par VSV-DsRed (MOI = 1) en présence ou en absence de VACV-FL-GFP (MOI = 25). Parce que VSV-DsRed exprime DsRed comme une protéine libre et n’est pas fusionné à protéines structurales de VSV (Figure 1 a), il est détecté…

Discussion

Ici, nous avons décrit simple base de fluorescence et de luminescence des tests pour dépister les conditions de sauvetage réplication VSV dans des cultures cellulaires de lépidoptères restrictives. L’infection avortée de la VSV dans les cellules lépidoptères crée un excellent rapport signal-bruit lors du dosage pour l’expression des gènes VSV. Par exemple, les signaux de LU détectés dans les lysats de simples infections VSV-LUC étaient ~ 1000 plus élevé que dans les lysats mock-infectés, mais ces sign…

Materials

6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum – Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5X	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104