Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.
Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.
PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de5,6. Pour résoudre ce problème, les alternatives thérapeutiques moins coûteux, un moyen d’identifier les patients susceptibles de gagner le plus d’avantages, ou les deux, sont nécessaires.
Approches de petit-molécule pourraient cibler PCSK9 intracellulaire, fournir une meilleure voie d’administration et réduire les coûts, rendant le « Saint Graal » dans cette zone7. Cependant, PCSK9 s’avère difficile à drogue de petites molécules. Comme une protéase, ciblant la fonction protéolytique de PCSK9 est une stratégie séduisante, comme self-protéolyse est l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation8 et est requise pour son effet maximal sur le LDL-R9. A ce jour, cependant, cette stratégie n’a pas été couronnée de succès, probablement en raison de la biochimie unique de PCSK9 : PCSK9 seulement se fend10, effectuant une réaction de simple-chiffre d’affaires, et après soi-clivage, la PCSK9 prodomain demeure lié au site actif comme une auto-inhibiteur11, empêchant l’affichage de toute autre activité de la protéase.
Cet article présente une méthode pour évaluer la fonction protéolytique PCSK9 en mode haut débit8. Par le biais de mutagenèse dirigée, enquêteurs peuvent utiliser ce test pour sonder les effets du codage SNP dans la clinique afin d’évaluer les effets sur la protéolyse, l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation. En outre, cette méthode sera utile dans la conception d’écrans de haut débit afin d’identifier des modulateurs de la protéolyse de PCSK9, qui devraient finalement perturbent la présentation de PCSK9 du LDL-r (et moduler l’effet hypercholestérolémiant de PCSK9) . Enfin, ce protocole peut être adapté aux autres protéases avec intrinsèquement faible activité, pourvu que i) une paire de substrat-protéase spécifique se retrouve, et ii) un point d’ancrage intracellulaire approprié peut être établi pour le substrat.
Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son …
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le généreux soutien financier du NHLBI/NIH (K08 HL124068 et LRP HMOT1243), NCATS/NIH par le biais de l’UCSF clinique et translationnelle Science Institute programme catalyseur (UL1 TR000004), le Sénat académique UCSF, la Fondation de Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un prix cardiovasculaire de Pfizer ASPIRE (tout John S. Chorba) et le Howard Hughes Medical Institute (à Adri M. Galvan et Kevan M. Shokat).
PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | 저자 | n/a | Available from authors |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | 저자 | n/a | Available from authors |
Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
(+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |