JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
유전학

Producerer gen sletninger i Escherichia coli af P1 transduktion med punktafgiftspligtige antibiotikaresistens kassetter

Published: September 01, 2018
doi:
10.3791/58267
, ,
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences,University of Oslo

Summary

Her præsenterer vi en protokol til brug af allerede eksisterende antibiotisk resistens-kassette sletning konstruktioner som grundlag for at foretage sletning mutanter i andre E. coli stammer. Sådan sletning mutationer kan mobiliseres og indsættes i den tilsvarende locus af en modtagende stamme ved hjælp af P1 bacteriophage transduktion.

Abstract

En første tilgang til at studere funktionen af en ukendt gen i bakterier er at skabe en knock-out af dette gen. Her, beskriver vi en robust og hurtig protokol til at overføre genmutationer sletning fra én Escherichia coli stamme til en anden ved hjælp af generaliseret transduktion med bacteriophage P1. Denne metode kræver, at mutationen er valgbar (f.eks. baseret på gen forstyrrelser ved hjælp af antibiotika kassette indrykninger). Sådanne antibiotika kassetter kan mobiliseres fra en donor stamme og tilføres en modtagende stamme af interesse for hurtigt og generere nemt en gen sletning mutant. Den antibiotiske kassette kan designes til at omfatte flippase anerkendelse steder der tillader excision af kassetten ved en lokationsspecifik recombinase at producere en ren knock-out med kun ~ 100-base par lange ar sekvens i genomet. Vi demonstrere protokollen ved at udskære tamA genet kodning en forsamling faktor involveret i autotransporter Biogenese og teste effekten af denne knock-out på Biogenese og funktion af to trimeric autotransporter adhesins. Selvom genet sletning af P1 transduktion har sine begrænsninger, gøre lethed og hastighed af dens gennemførelse det et attraktivt alternativ til andre metoder til gen sletning.

Introduction

En fælles første tilgang til at studere funktionen af et gen er at udføre knock-out mutagenese og observere den resulterende fænotype. Dette kaldes også omvendt genetik. Bakterien E. coli har været arbejdshesten i Molekylærbiologi for de sidste 70 år eller så, på grund af lethed af dens dyrkning og sin imødekommenhed til genmanipulation1. Flere metoder er blevet udviklet for at producere gen sletninger i E. coli, herunder markør exchange mutagenese2,3 og mere for nylig, recombineering bruger λ rød eller Rac ET systemer4,5 , 6.

I et almindeligt anvendte system, er kodning sekvenser af enkelte gener erstattet af en antibiotisk resistens kassette, der senere kan være skåret ud fra kromosom5,7. De kodning sekvenser erstattes, for eksempel ved en kanamycin (Kan) modstand kassette, der er flankeret af flippase (FLP) genkendelsessekvenser mål (FRT) på begge sider. FRT websteder er anerkendt af recombinase FLP, der medierer lokationsspecifikke rekombination mellem FRT websteder fører til sletning af Kan kassette. På denne måde opnås en fuldstændig sletning af en given genet kodende sekvens på efterlod kun en minimal ar sekvens af ca. 100 basepar (bp) (figur 1).

Lidt over et årti siden, blev den såkaldte Keio samling udviklet. Dette er en bakteriel bibliotek baseret på en standard laboratorium E. coli K12 stamme, hvor næsten alle ikke-væsentlige gener var individuelt slettet af λ røde rekombination7,8. Kloner i denne samling har en kodende sekvens erstattet med en punktafgiftspligtige Kan modstand kassette. Samlingen Keio har vist sig for at være et nyttigt redskab for mange applikationer9. En sådan anvendelse er produktion af sletning mutanter i andre E. coli stammer. Kan kassette fra en given sletning klon kan tilvejebringes af generelt transducing Bakteriofager, som P110,11,12,13,14. En phage bestand fremstillet af sådan en stamme kan derefter bruges til at inficere en modtager E. coli stamme af interesse, hvor en lav, men pålidelige frekvens Kan kassette-holdige region kan indarbejdes i den modtagende genom af homologe rekombination (Figur 2). Transductants kan vælges for vækst på de Kan-holdige medium. Efter dette, eventuelt fjernelse af antibiotikaresistens kassette kan FLP recombinase også leveres til transductant stammen i trans. Efter hærdning FLP-holdige plasmidet, som bærer en ampicillin (Amp) modstand markør, Kan og Amp-følsomme kloner er screenet for, og den korrekte excision af vildtype kodende sekvens og Kan kassette er verificeret af kolonien PCR.

Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver hvert af trinene i producerer en knock-out E. coli stamme baseret på den strategi, der er skitseret ovenfor. Som et eksempel, er en sletning af tamA -genet påvist. tamA koder en ydre membran β-tønde protein, der er en del af Transport og montage modul (TAM), som er involveret i Biogenese af visse autotransporter proteiner og pili15,16,17. Denne knock-out stamme blev derefter brugt til at undersøge effekten af tamA sletning på Biogenese to trimeric autotransporter adhesins (TAAs), Yersinia adhesin YadA og E. coli immunglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.

Protocol

1. stammer og plasmider Bakteriestammer Bruge E. coli stammer BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20og BL21ΔABCF21. Yderligere oplysninger finder du i Tabellen af materialer . Bakteriofager Bruge phage P1vir for den generelle transduktion. Gemme phage som en flydende materiel med et …

Representative Results

Generation af en tamA Knock-out af BL21ΔABCF: Den strategi, der er skitseret ovenfor har tidligere været brugt til at producere en afledte stamme af BL21(DE3), en standard laboratorium stamme anvendes ved produktion af protein, som er optimeret til ydre membran protein produktion og kaldte BL21ΔABCF21. Denne stamme mangler fire gener, der koder for rigelige ydre Membranproteiner og derfor er i st…

Discussion

P1 transduktion er en hurtig, robust og pålidelig metode til at generere gen sletninger i E. coli. Det fremgår her af transducing en tamA sletning mutant fra en Keio donor stamme til en BL21-afledte modtager. Hovedstadier i signaltransduktion proces er produktionen af den transducing lysate, transduktion selv, excision af Kan modstand kassette og verifikation af knock-out ved PCR. I alt, processen tager ca 1 uge og kræver ingen molekylærbiologiske metoder der skal anvendes, ud over den endelige PCR …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Keio samling stammer blev indhentet fra de nationale BioResource projekt (NIG, Japan): E. coli. Vi takker Dirk Linke (Institut for biovidenskab, universitetet i Oslo) for hans fortsatte støtte. Dette arbejde blev finansieret af Forskningsrådet for Norge unge forsker grant 249793 (til Jack C. Leo).

Materials

Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Tags

Keywords: P1 TransductionGene DeletionEscherichia ColiAntibiotic Resistance CassetteKnockout MutantPhageBacterial CultureLysogeny BrothCentrifugationChloroformSodium Citrate
check_url/kr/58267?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image