Produsere Gene slettingene i Escherichia coli av P1 signaltransduksjon med Excisable antibiotikaresistens kassetter
Summary
Her presenterer vi en protokoll for bruk av eksisterende antibiotikumet motstand-kassett sletting konstruksjoner som grunnlag for å gjøre sletting mutanter i andre E. coli stammer. Slike sletting mutasjoner kan være mobilisert og satt inn i tilsvarende locus mottaker belastning bruker P1 bacteriophage signaltransduksjon.
Abstract
En første tilnærming til studere funksjonen til en ukjent genet i bakterier er å skape en knock-out av dette genet. Her beskriver vi en robust og rask protokoll for overføring av genet sletting mutasjoner fra en Escherichia coli stamme til en annen ved hjelp av generalisert signaltransduksjon bacteriophage P1. Denne metoden krever at mutasjon være valgbar (f.eks basert på gene forstyrrelser med antibiotika kassett innsettinger). Slike antibiotika kassetter kan mobiliseres fra en donor belastning og introdusert til en mottaker belastning av interesse for raskt og generere enkelt en genet sletting mutant. Antibiotika kassetten kan utformes med flippase gjenkjennelse nettsteder som lar eksisjon av kassetten av en områdespesifikk recombinase å produsere en ren knock-out med bare en ~ 100-base-par-lange arr sekvens i genomet. Vi demonstrere protokollen av fortrenging tamA genet koding en montering faktor i autotransporter biogenesis og teste effekten av denne knock-out på biogenesis og funksjon av to trimeric autotransporter adhesins. Om genet sletting av P1 signaltransduksjon har begrensninger, gjør den enkle og hastigheten på implementeringen det et attraktivt alternativ til andre metoder for genet sletting.
Introduction
En felles første tilnærming til å studere et gen funksjon er å utføre knock-out mutagenese og observere resulterende fenotypen. Dette kalles også omvendt genetikk. Bakterien E. coli er arbeidshesten fra molekylærbiologien for de siste 70 årene eller så, enkel sin dyrking og dens amenability genetisk manipulasjon-1. Flere metoder har blitt utviklet for å produsere genet slettingene i E. coli, inkludert markør exchange mutagenese2,3 og, mer nylig, recombineering bruker λ rød eller Rac ET systemer4,5 , 6.
I en mye brukt system, er koding sekvenser av enkelte gener erstattet av en antibiotikaresistens kassett som kan senere kreditert fra kromosom5,7. Koding sekvensene er erstattet, for eksempel med en kanamycin (Kan) motstand kassett, som er flankert av flippase (FLP) anerkjennelse (FRT) målområder på hver side. Webområdene FRT gjenkjennes av recombinase FLP, som formidler områdespesifikke rekombinasjon mellom FRT områder fører til sletting av Kan kassetten. På denne måten kan en fullstendig sletting av et gitt gen koding oppnås, og etterlot seg bare en minimal arr sekvens av omtrent 100 base parene (bp) (figur 1).
Bare over et tiår siden, ble såkalte Keio samlingen utviklet. Dette er en bakteriell bibliotek som er basert på en standard laboratorium E. coli K12 belastning, der nesten alle ikke-essensielle gener individuelt ble slettet av λ rød rekombinasjon7,8. Kloner i denne samlingen hvert har en koding sekvens erstattet med en excisable Kan motstand kassett. Keio samlingen har vist seg for å være et nyttig verktøy for mange programmer9. Et slikt program er produksjon av sletting mutanter i andre E. coli stammer. Kan kassetten fra en gitt sletting klone kan mobiliseres av generelt transducing bacteriophages, som P1,10,,11,,12,,13,,14. En phage lager forberedt fra slik en belastning kan deretter brukes til å infisere en mottaker E. coli stamme av interesse, hvor på en lav, men pålitelig frekvens Kan kassett inneholder regionen kan innlemmes i mottakerens genomet av homologe rekombinasjon (Figur 2). Transductants kan velges for vekst på Kan inneholder mediet. Etter dette, eventuelt fjerning av antibiotikaresistens kassetten er kan FLP recombinase leveres til transductant belastning i trans. Etter FLP inneholder plasmider, som bærer en ampicillin (Amp) motstand markør, Kan og Amp-sensitive kloner er vist for, og den riktige eksisjon av vill-type koding sekvensen og Kan kassetten bekreftes av kolonien PCR.
Her vises en detaljert protokoll, beskriver hvert trinn i å produsere en knock-out E. coli belastning basert på strategi skissert ovenfor. Som et eksempel, er sletting av tamA genet demonstrert. tamA koder en ytre membran β fat protein som er en del av Transport og montering modul (TAM) som er involvert i biogenesis av visse autotransporter proteiner og pili15,16,17. Denne knock-out belastningen ble brukt til å undersøke effekten av tamA sletting på biogenesis av to trimeric autotransporter adhesins (TAAs) og Yersinia adhesin YadA E. coli immunglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
P1 signaltransduksjon er en rask, robust og pålitelig metode for å generere genet slettinger i E. coli. Dette er demonstrert her av transducing en tamA sletting mutant fra en Keio donor belastning til en BL21-avledet mottaker. Store stadier i signaltransduksjon prosess er produksjon av den transducing lysate, signaltransduksjon selv, eksisjon av Kan motstand kassetten og verifisering av knock-out av PCR. Totalt prosessen tar ca 1 uke og krever ingen molekylærbiologi metoder brukes, bortsett fra den s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keio samling stammer ble innhentet fra National BioResource Project (NIG, Japan): E. coli. Vi takker Dirk Linke (avdeling av biovitenskap, UiO) for sin fortsatte støtte. Dette arbeidet ble finansiert av forskningsråd Norge ung forsker grant 249793 (til Jack C. Leo).
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
