Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa
Summary
Qui presentiamo un protocollo per l’uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.
Abstract
Un primo approccio per studiare la funzione di un gene sconosciuto nei batteri è quello di creare un knock-out di questo gene. Qui, descriviamo un protocollo robusto e veloce per trasferire le mutazioni di omissione del gene da un ceppo di Escherichia coli a altro mediante trasduzione generalizzata con il batteriofago P1. Questo metodo richiede che la mutazione sia selezionabile (ad es., basato su interruzioni di gene usando gli inserimenti cassetta antibiotico). Tali cassette antibiotici possono essere mobilitate da un ceppo di donatore e introdotto in un ceppo destinatario di interesse per rapidamente e facilmente generano un mutante di delezione del gene. La cassetta di antibiotica può essere progettata per includere siti di riconoscimento flippase che consentono l’asportazione della cassetta da una ricombinasi site-specific per produrre un knock-out pulito con solo una sequenza di ~ 100-base-coppia-lunga cicatrice nel genoma. Dimostriamo il protocollo battendo fuori il tamA gene codifica per un fattore di assemblaggio coinvolto nella biogenesi autotransporter e testare l’effetto di questo knock-out sulla biogenesi e funzione di due trimerico autotransporter adesine. Sebbene l’omissione del gene di trasduzione P1 ha i suoi limiti, la facilità e la velocità della sua attuazione rendono una valida alternativa ad altri metodi di omissione del gene.
Introduction
Un primo approccio comune per studiare la funzione di un gene è quello di eseguire la mutagenesi di knock-out e osservare il fenotipo risultante. Questo è definito anche genetica inversa. Il batterio e. coli è stato il cavallo di battaglia della biologia molecolare negli ultimi 70 anni o così, a causa della facilità della sua coltura e la sua disponibilità a manipolazione genetica1. Sono stati sviluppati diversi metodi per produrre le eliminazioni genica in Escherichia coli, compreso indicatore cambio mutagenesi2,3 e, più recentemente, recombineering utilizzando il λ rosso o Rac ET sistemi4,5 , 6.
In un sistema ampiamente usato, sequenze di codificazione dei geni individuali vengono sostituiti da una cassetta di resistenza agli antibiotici che possa successivamente essere asportata dal cromosoma5,7. Le sequenze di codificazione sono sostituite, per esempio da una cassetta di resistenza alla kanamicina (Kan), fiancheggiata da siti di destinazione (FRT) riconoscimento flippase (FLP) su entrambi i lati. I siti FRT sono riconosciuti dalla ricombinasi FLP, che media site-specific di ricombinazione tra i siti FRT che conduce all’eliminazione della cassetta Kan. In questo modo, è possibile una cancellazione completa della sequenza codificante di un dato gene, lasciando dietro di sé solo una sequenza di cicatrice minima di circa 100 coppie di basi (bp) (Figura 1).
Poco più di un decennio fa, è stata sviluppata il cosiddetta collezione di Keio. Si tratta di una libreria batterica basata su un ceppo di e. coli K12, standard di laboratorio dove quasi tutti i geni non essenziali sono stati eliminati singolarmente da λ ricombinazione rosso7,8. I cloni all’interno della raccolta ogni hanno una sequenza di codificazione sostituito con una cassetta di resistenza Kan soggetti ad accisa. La collezione di Keio ha dimostrato di essere uno strumento utile per molte applicazioni9. Una tale applicazione è la produzione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . La cassetta di Kan da un clone di eliminazione specificato possa essere mobilitata da generalmente transducing batteriofagi, ad esempio P110,11,12,13,14. Un brodo di fago preparato da una simile tensione quindi può essere utilizzato per infettare un destinatario Escherichia coli ceppo di interesse, dove ad una frequenza bassa ma affidabile il Kan regione contenente cassette possa essere incorporate nel genoma del destinatario tramite la ricombinazione omologa (Figura 2). Transductants possono essere selezionati per la crescita sul supporto di Kan-contenente. In seguito, se si desidera la rimozione della cassetta di resistenza agli antibiotici, la ricombinasi FLP possono essere forniti al ceppo transductant in trans. Dopo l’indurimento il plasmide contenente FLP, che trasporta un marcatore di resistenza all’ampicillina (Amp), Kan e Amp-sensibile cloni sono schermati per, e la corretta asportazione del selvaggio-tipo sequenza di codificazione e la cassetta di Kan sono verificate mediante PCR della Colonia.
Qui, un protocollo dettagliato è presentato, che descrive tutti i passaggi nella produzione di un knock-out ceppo di e. coli sulla base della strategia descritta sopra. Ad esempio, è dimostrata un’omissione del gene di tamA . tamA codifica per una proteina del β-barilotto di membrana esterna che è una parte del trasporto e montaggio modulo (TAM), che è coinvolto nella biogenesi di determinate proteine autotransporter e pili15,16,17. Questo ceppo di knock-out è stato poi utilizzato per esaminare l’effetto dell’eliminazione tamA sulla biogenesi di due trimerico autotransporter adesine (TAA), l’adesina di Yersinia YadA e l’immunoglobulina (Ig) di Escherichia coli -associazione TAA EibD 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La trasduzione P1 è un metodo veloce, robusto e affidabile per la generazione di delezioni del gene dentro e. coli. Questo è dimostrato qui di trasdurre un mutante di delezione di tamA da un ceppo di donatore Keio a un destinatario BL21-derivato. Le principali fasi del processo di trasduzione sono la produzione della trasduzione lisata, trasduzione del sé, l’asportazione della cassetta Kan resistenza e per la verifica di knock-out mediante PCR. In totale, il processo richiede circa 1 settimana e non …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ceppi di Keio collezione sono stati ottenuti dal progetto nazionale BioResource (NIG, Giappone): e. coli. Ringraziamo Dirk Linke (dipartimento di scienze biologiche, Università di Oslo) per il suo continuo sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca della Norvegia Young Researcher grant 249793 (per Jack C. Leo).
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
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