Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo
Summary
Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.
Abstract
El tejido adiposo juega un papel central en la homeostasis de la energía y la termorregulación. Se compone de diferentes tipos de adipocitos, como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasos sanguíneos y las proyecciones del nervio. Aunque el control molecular de la especificación del tipo de la célula y cómo interactúan estas células han sido cada vez más delineados, se logra una comprensión más completa de estas células reside en el adiposo por visualizar su distribución y arquitectura a lo largo de todo tejido. Enfoques existentes de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar la histología adiposa confían en finas secciones parafina-encajadas. Sin embargo, secciones delgadas capturan sólo una pequeña porción de tejido; como resultado, las conclusiones pueden estar sesgadas por qué porción del tejido se analiza. Por lo tanto hemos desarrollado un limpieza técnica, Adipo-claro, para permitir la visualización tridimensional completa de patrones moleculares y celulares en todo los tejidos adiposo el tejido adiposo. Adipo-clara es una adaptación del iDISCO / iDISCO +, con modificaciones específicas a eliminar los lípidos almacenados en el tejido preservando morfología de tejido propio. En combinación con la microscopía de fluorescencia de luz de hoja, aquí demostramos el uso del método para obtener imágenes en alta resolución volumétricas de un tejido adiposo todo Adipo-claro.
Introduction
Hasta hace poco, el tejido adiposo fue concebido como una colección amorfa de células de grasa. En las últimas décadas, nuestra comprensión ha crecido más sofisticada, con grasas, ahora reconocido como un órgano complejo que contiene diferentes tipos de adipocitos, así como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasculatura y proyecciones del nervio. Interacciones entre estas células reside en el adiposo han marcado efectos sobre el tejido adiposo y la fisiología y Fisiopatología1. Aunque estudios emergentes han desentrañando importantes mecanismos moleculares subyacentes a ciertas interacciones, una comprensión más integral requiere perfiles estructurales fiables del todo tejido en tres dimensiones (3D).
Nuestro actual conocimiento de la morfología del tejido adiposo en gran parte se basa en el análisis histológico de secciones delgadas (5 μm) con la proyección de imagen relativamente alta magnificación (más de 10 X)2,3. Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones importantes. Primeras, intrincadas estructuras filamentosas como los nervios simpáticos y la vasculatura que se saben para desempeñar un papel importante en la función adiposo4,5,6,7, son difíciles de evaluar a través de secciones delgadas. En segundo lugar, debido a su forma aparentemente amorfa y la falta de unidades estructurales representativas centrarse, es difícil apreciar las estructuras de tejido adiposo basadas sólo en la sección coloración. En tercer lugar, el tejido adiposo tiene un contenido de lípidos muy alto, creando dificultades en la obtención de secciones seriadas consistente que son adecuadas para la reconstrucción anatómica 3D, un método convencional utilizado para el estudio de la morfología de todo el cerebro8. Teniendo en cuenta estos factores, hay una gran necesidad de un enfoque conjunto de montaje que permiten la visualización en 3D de un depósito adiposo todo mientras todavía lograr resolución celular.
La proyección de imagen volumétrica 3D de un órgano completo es un reto debido a la ocultación de la dispersión de la luz. Una importante fuente de dispersión de la luz en los tejidos biológicos viene de interfaces lípido-acuoso. Aunque los esfuerzos para eliminar la dispersión mediante la eliminación de lípidos han sido permanente para más de un siglo, ha habido un gran número de innovaciones recientes9. Un tal método de remoción de tejido desarrollado recientemente es imágenes en 3D basados en la inmunomarcación de órganos despejó de solvente (iDISCO / iDISCO +)10,11. Sin embargo, el tejido adiposo presenta un desafío particular dado su alto nivel de lípidos y por lo tanto, modificaciones adicionales a la iDISCO iDISCO + protocolo son necesarios para extraer completamente los lípidos mientras que protege el tejido contra colapso. El protocolo modificado que hemos desarrollado, ahora se llama Adipo-claro, emplea delipidation basado en diclorometano/metanol de tejido adiposo para conseguir la óptima transparencia conveniente para la proyección de imagen volumétrica alta resolución12. Porque el delipidation paso en gran parte arrestina endógeno expresan proteínas fluorescentes GFP y RFP, visualización de tales proteínas debe lograrse por inmunomarcación. En general, este Protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización nivel de tejido adiposo residente células, rastreo de linaje de células progenitoras de adipocito y adiposo morfogénesis durante el desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear es un método sencillo y robusto para la eliminación de tejido adiposo, que puede realizarse fácilmente en una configuración de laboratorio regulares. En comparación con otros métodos de limpieza basados en solventes como iDISCO iDISCO +10,11,12, Adipo-clara es especialmente optimizadas para despejar el tejido adiposo y otros tejidos con alto contenido de grasa. El paso de delipidation completamente elimina líp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong y Alison North desde el centro de recursos de Bioimagen en la Universidad de Rockefeller para la asistencia y apoyo. También agradecemos a Xiphias Ge Zhu para la edición de la película. Este trabajo fue apoyado por el humano frontera ciencia programa organización (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
