Adipo-स्पष्ट: वसा ऊतक के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि
Summary
उच्च लिपिड सामग्री के कारण, वसा ऊतक पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक तरीकों का उपयोग कर कल्पना करने के लिए चुनौती दी गई है । Adipo-स्पष्ट एक ऊतक समाशोधन तकनीक है कि मजबूत लेबलिंग और उच्च संकल्प वसा ऊतक के volumetric फ्लोरोसेंट इमेजिंग की अनुमति देता है । यहां, हम नमूना तैयारी, उपचार, धुंधला, समाशोधन, और इमेजिंग के लिए बढ़ते के लिए तरीकों का वर्णन ।
Abstract
वसा ऊतक ऊर्जा homeostasis और thermoregulation में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है । यह विभिंन प्रकार के adipocytes से बना है, साथ ही adipocyte पुरोगामी, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, रक्त वाहिकाओं, और तंत्रिका अनुमानों । हालांकि सेल प्रकार विनिर्देश के आणविक नियंत्रण और कैसे इन कोशिकाओं बातचीत तेजी से delineated किया गया है, इन वसा निवासी कोशिकाओं की एक अधिक व्यापक समझ उनके वितरण और वास्तुकला visualizing द्वारा प्राप्त किया जा सकता पूरे ऊतक के दौरान । मौजूदा immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण वसा प्रोटोकॉल का विश्लेषण करने के लिए पतली तेल-एंबेडेड वर्गों पर भरोसा करते हैं । हालांकि, पतले वर्गों ऊतक के केवल एक छोटे से हिस्से पर कब्जा; नतीजतन, निष्कर्ष ऊतक के किस भाग से पक्षपातपूर्ण हो सकता है विश्लेषण किया है । इसलिए हम एक वसा ऊतक समाशोधन तकनीक, Adipo स्पष्ट विकसित की है, पूरे वसा ऊतकों में आणविक और सेलुलर पैटर्न के व्यापक तीन आयामी दृश्य की अनुमति है । Adipo-स्पष्ट iDISCO/iDISCO + से अनुकूलित किया गया था, विशिष्ट संशोधनों के साथ पूरी तरह से ऊतक में संग्रहीत लिपिड को हटाने के लिए बनाया है, जबकि देशी ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण. प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, हम यहां Adipo के उपयोग-स्पष्ट विधि एक पूरे वसा ऊतक के उच्च संकल्प volumetric छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
Introduction
हाल ही में जब तक, वसा ऊतक वसा कोशिकाओं का एक अमली संग्रह के रूप में की कल्पना की थी । पिछले कुछ दशकों में, हमारी समझ और अधिक परिष्कृत हो गया है, वसा के साथ अब एक जटिल adipocytes के विभिंन प्रकार युक्त अंग होना मांयता प्राप्त है, साथ ही साथ adipocyte पुरोगामी, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, vasculature, और तंत्रिका अनुमानों । इन वसा-निवासी कोशिकाओं के बीच बातचीत वसा ऊतक और जीव फिजियोलॉजी और pathophysiology1पर प्रभाव स्पष्ट किया है । हालांकि उभरते अध्ययन महत्वपूर्ण आणविक कुछ बातचीत अंतर्निहित तंत्र सुलझाया है, एक अधिक व्यापक समझ तीन आयामों (3 डी) में पूरे ऊतक के विश्वसनीय संरचनात्मक रूपरेखा की आवश्यकता है ।
वसा ऊतक आकृति विज्ञान के हमारे वर्तमान ज्ञान मोटे तौर पर अपेक्षाकृत उच्च आवर्धन इमेजिंग (10x से अधिक)2,3के साथ पतले वर्गों (5 माइक्रोन) के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण पर आधारित है । हालांकि, इस approach कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । पहला, ऐसी सहानुभूति तंत्रिकाओं और vasculature, जो वसा समारोह4,5,6,7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है के रूप में जटिल रेशा संरचनाओं का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है पतले वर्गों के माध्यम से । दूसरा, अपनी प्रतीत होता है अमली आकार और प्रतिनिधि संरचनात्मक इकाइयों की कमी के कारण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, यह मुश्किल है वसा ऊतक संरचनाओं केवल अनुभाग धुंधला पर आधारित की सराहना करते हैं । तीसरा, वसा ऊतक एक बहुत ही उच्च लिपिड सामग्री है, लगातार धारावाहिक वर्गों है कि 3 डी संरचनात्मक पुनर्निर्माण, एक पारंपरिक पूरे मस्तिष्क आकृति विज्ञान8अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल के लिए उपयुक्त है प्राप्त करने में चुनौतियों का निर्माण । इन कारकों को देखते हुए, वहां एक पूरे माउंट दृष्टिकोण है कि एक पूरे वसा डिपो के 3 डी दृश्य प्रदान करते हुए अभी भी सेलुलर संकल्प प्राप्त कर सकते है के लिए एक बड़ी जरूरत है ।
एक पूरे अंग के 3 डी volumetric इमेजिंग प्रकाश बिखराव के अस्पष्ट प्रभाव के कारण चुनौतीपूर्ण है । जैविक ऊतकों में प्रकाश बिखराव का एक प्रमुख स्रोत लिपिड-जलीय इंटरफेस से आता है । हालांकि लिपिड को हटाने के द्वारा बिखराव को खत्म करने के प्रयास एक सदी से अधिक के लिए चल रहा है, वहां हाल ही में9नवाचारों की एक बड़ी संख्या में किया गया है । एक ऐसी नव विकसित ऊतक-समाशोधन विधि immunolabeling है-सक्षम 3d इमेजिंग विलायक मंजूरी दे दी अंगों (iDISCO/iDISCO +)10,11। हालांकि, वसा ऊतक एक विशेष अपने लिपिड के उच्च स्तर दिया चुनौती प्रस्तुत करता है, और इसलिए, iDISCO/iDISCO + प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त संशोधनों को पूरी तरह से लिपिड निकालने जबकि टूट से ऊतक की रक्षा करने के लिए आवश्यक हैं । संशोधित प्रोटोकॉल हम विकसित किया है, अब Adipo कहा जाता है-स्पष्ट, उच्च संकल्प volumetric इमेजिंग12के लिए उपयुक्त इष्टतम पारदर्शिता को प्राप्त करने के लिए वसा ऊतक के मेथनॉल/dichloromethane आधारित लिपिड रोजगार । क्योंकि लिपिड कदम काफी हद तक बुझती endogenously ऐसे GFP और आरएफपी के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की, ऐसे प्रोटीन के दृश्य immunolabeling द्वारा प्राप्त किया जाना चाहिए । कुल मिलाकर, यह सरल और मजबूत प्रोटोकॉल ऊतक के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है-वसा निवासी कोशिकाओं के स्तर संगठन, adipocyte जनक कोशिकाओं के वंश अनुरेखण, और विकास के दौरान वसा morphogenesis ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-स्पष्ट वसा ऊतक समाशोधन के लिए एक सरल और मजबूत तरीका है, जो आसानी से एक नियमित प्रयोगशाला सेटअप में किया जा सकता है । अंय विलायक आधारित समाशोधन विधियों की तुलना में जैसे iDISCO/iDISCO +10,11<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सहायता और समर्थन के लिए रॉकफेलर विश्वविद्यालय में सी इमेजिंग संसाधन केंद्र से क्रिस्टीना Pyrgaki, ताओ टोंग, और एलिसन उत्तर धंयवाद । हम भी फिल्म संपादन के लिए Xiphias जीई झू धंयवाद । इस काम को मानव सीमांत विज्ञान कार्यक्रम संगठन (पीसी) ने समर्थन दिया था.
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
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