Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev
Summary
På grunn av høy lipid innhold, har fettvev vært utfordrende for å visualisere bruke tradisjonelle histologiske metoder. Adipo-Clear er en vev fjerne teknikk som gjør at robust merking og høy oppløsning volumetriske fluorescerende avbilding av fettvev. Her beskriver vi metodene for eksempel forberedelse, forbehandling, flekker, fjerne og montering for bildebehandling.
Abstract
Fettvev spiller en sentral rolle i energi homeostasis og thermoregulation. Det består av ulike typer adipocytter, samt adipocyte forløpere, immunceller, fibroblaster, blod fartøy og nerve anslag. Selv om molekylære kontroll av cellen spesifikasjon og hvordan disse cellene samhandler har blitt mer avgrenset, kan en mer omfattende forståelse av disse liggende under adipose-resident cellene oppnås ved å visualisere deres distribusjon og arkitektur gjennom hele vevet. Eksisterende immunohistochemistry og immunofluorescence tilnærminger til å analysere adipose histology er avhengige av tynne parafin-embedded snitt. Men ta tynne snitt bare en liten del av vev; Derfor kan konklusjonene være partisk av hvilken del av vev er analysert. Derfor har vi utviklet en fettvev fjerne teknikk, Adipo-klare, for å gi omfattende tredimensjonale visualisering av molekylære og mobilnettet mønstre i hele liggende under adipose vev. Adipo-klare ble tilpasset fra iDISCO / iDISCO +, med endringer gjort å fjerne lipid lagret i vevet samtidig bevare opprinnelige vev morfologi. I kombinasjon med lys arks fluorescens mikroskopi viser vi her bruk av metoden Adipo-klare å få volumetriske oppløsning av en hel fettvev.
Introduction
Inntil nylig ble fettvev oppfattet som en amorf samling av fett celler. De siste tiårene vokst vår forståelse mer sofistikert, med fett nå anerkjent å være en kompleks organ som inneholder ulike typer adipocytter, samt adipocyte forløpere, immunceller, fibroblaster, blodkar og nerve anslag. Interaksjon mellom disse liggende under adipose-resident cellene har uttalt fettvev og organismebiologi fysiologi og patofysiologi1. Selv om nye studier har unraveled viktig molekylære mekanismer underliggende visse interaksjon, krever en mer omfattende forståelse pålitelig strukturelle profilering av hele vev i tre dimensjoner (3D).
Vår nåværende kunnskap om fettvev morfologi er hovedsakelig basert på histologiske analyse av tynne snitt (5 μm) med relativt høy forstørrelse imaging (mer enn 10 X)2,3. Denne tilnærmingen har imidlertid flere betydelige begrensninger. Første, intrikate trådformede strukturer som sympatiske nerver og blodkar, som er kjent for å spille en viktig rolle i adipose funksjonen4,5,6,7, er vanskelig å vurdere gjennom tynne snitt. Andre formen tilsynelatende amorfe og mangel på representant strukturell enhet å fokusere på, er det vanskelig å verdsette fettvev strukturer basert på delen flekker. Tredje har fettvev en svært høy lipid innhold, skape utfordringer i å få konsekvent føljetong deler som passer for 3D anatomiske rekonstruksjon, en tradisjonell metoden brukes til å studere hele hjernen morfologi8. Gitt disse faktorene, er det et stort behov for en hel-mount tilnærming som kan gi 3D visualisering av en hel adipose depot mens fortsatt oppnå mobilnettet oppløsning.
3D volumetriske avbildning av et hele organ er utfordrende på grunn av obscuring effektene av lys punkt. En viktig kilde til lys scatter i biologisk vev kommer fra lipid-vandig grensesnitt. Selv om arbeidet med å eliminere scatter ved å fjerne lipider har pågått for over et århundre, har det vært en rekke nyere innovasjoner9. En slik nyutviklet vev-clearing metode er immunolabeling-aktiverte 3D-bildebehandling løsemiddel klarert organer (iDISCO / iDISCO +)10,11. Imidlertid fettvev presenterer en spesiell utfordring gitt sin høye nivå av lipider, og derfor ytterligere modifiseringer å iDISCO / iDISCO + protokollen kreves for å trekke fullt av lipider samtidig beskytte vevet sammen. Endret protokollen har vi utviklet, nå kalt Adipo-klare, sysselsetter metanol/diklormetan-baserte delipidation av fettvev å oppnå optimal åpenhet egnet for høy oppløsning volumetriske tenkelig12. Fordi delipidation går hovedsakelig slukker endogenously uttrykt fluorescerende proteiner som GFP og RFP, må visualisering av slike proteiner oppnås ved immunolabeling. Total, denne enkel og robust protokollen kan brukes for å studere vev-nivå organiseringen av liggende under adipose-resident celler, avstamning sporing av adipocyte stamfar celler og adipose morphogenesis under utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear er en enkel og robust metode for å fjerne fettvev, som lett kan utføres i en vanlig laboratorium setup. I forhold til andre løsemiddelbaserte clearing metoder som iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo klart er spesielt optimalisert for sletting av fettvev og andre vev med høyt fettinnhold. Delipidation trinnet fjerner fullstendig lipider fra liggende under adipose, og dermed muliggjør immunolabeling gjennom hele veve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christina Pyrgaki Tao Tong og Alison North fra Ressurssenter Bioimaging ved Rockefeller University for hjelp og støtte. Vi takker også Xiphias Ge Zhu for film redigering. Dette arbeidet ble støttet av den menneskelige Frontier vitenskap Program organisasjon (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
