Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller
Summary
Detta protokoll införs en enkel två-stegs metod för att skilja korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller xeno- och villkor feeder cellfria kultur. De cell kultur metoder presenteras här möjliggör kostnadseffektiva, storskaliga produktionen av klinisk kvalitet celler gäller för korneal cell terapi användning.
Abstract
Hornhinnans limbala stamceller epitelceller (LESCs) ansvarar för kontinuerligt förnya hornhinneepitelet och därmed upprätthålla korneal homeostas och visuell tydlighet. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda LESCs ger en lovande cell källa för korneal cell substitutionsterapi. Odefinierad, xenogena kultur och differentiering förhållanden orsaka förändring forskningsresultat och hindra klinisk översättning av hPSC-derived therapeutics. Detta protokoll ger en reproducerbar och effektiv metod för hPSC-ESF LESC differentiering xeno- och feeder cellfria villkor. För det första fungerar enskiktslager kultur av odifferentierade hPSC på rekombinant laminin-521 (LN-521) och definierade hPSC medium som en grund för robust produktion av högkvalitativa utgångsmaterial för differentieringar. För det andra, en snabb och enkel hPSC-ESF LESC differentiering metod ger ESF LESC populationer i bara 24 dagar. Metoden innehåller en fyra dagars ytan ektodermala induktion i suspension med små molekyler, följt av vidhäftande kultur fas på LN-521/kollagen IV kombination matris i definierade korneal epitelial differentiering medium. Cryostoring och utökade differentiering ytterligare renar cell befolkningen och möjliggör Bank av cellerna i stora mängder för cellterapi. De resulterande hög kvalitet hPSC-LESCs ge en potentiell ny behandlingsstrategi för hornhinnans yta återuppbyggnad att behandla brist på limbala stamceller (LSCD).
Introduction
Den genomskinliga hornhinnan på den okulära ytan tillåter ljus komma näthinnan och ger majoriteten av ögats brytningsförmåga. Det yttersta lagret, stratifierat hornhinnans epitel, är kontinuerligt regenereras genom limbala epitelial stamceller (LESCs). LESCs finnas i de basala lagret av de limbala nischerna på corneoscleral junction1,2. LESCs saknar specifik och unik markörer, så deras identifiering kräver en mer omfattande analys av en uppsättning förmodad markörer. Epitelial transkription faktorn p63 och särskilt N-terminalt trunkerade avskrift av den alfa isoformen av p63 (ΔNp63α), har föreslagits som en relevant positiva ESF LESC marker3,4. Asymmetrisk fördelning av LESCs tillåter dem att själv förnya, men också producera avkomma som migrerar centripetally och anteriorly. Som cellerna framsteg mot hornhinnans yta de gradvis förlorar sin stemness och slutligen obotligt differentiera till ytlig Skivepitelcancer celler som kontinuerligt försvinner från hornhinnans yta.
Skada på någon av hornhinnans lager kan leda till allvarlig synnedsättning och korneal defekter är således en av de främsta orsakerna till synnedsättning i hela världen. I brist på limbala stamceller (LSCD) förstörs limbus av sjukdom eller trauma som leder till conjunctivalization och grumling av hornhinnans yta och efterföljande förlust av vision5,6. Cell substitutionsterapi med autologa eller allogena limbala ympkvistar erbjuder en behandlingsstrategi för patienter med LSCD4,7,8,9. Men skörd autologa transplantat bär en risk för komplikationer för det friska ögat och givarens vävnad är en bristvara. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), specifikt mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan fungera som en obegränsad källa av kliniskt relevanta celltyper, inklusive korneal epitelceller. HPSC-derived LESCs (hPSC-LESCs) utgör därför en attraktiv ny cell källa för okulär cell substitutionsterapi.
Traditionellt, både de odifferentierade hPSC kultur metoderna och deras differentiering protokoll till LESCs har förlitat sig på användning av odefinierade feeder celler, animaliska sera, luftkonditionerade medier eller fostervattnet membran10,11, 12 , 13 , 14 , 15. nyligen, insatser mot säkrare cellterapi har föranlett sökandet efter mer standardiserade och xeno-fri kultur och differentiering-protokoll. Som ett resultat, är flera definierade och xeno-fria metoder för långtidsodling av odifferentierade hPSCs kommersiellt tillgängliga16,17,18. Som ett kontinuum, riktad differentiering protokoll som förlitar sig på molekylär ledtrådar att vägleda hPSCs till hornhinnans epitel öde har nyligen introducerat19,20,21,22, 23. Ännu används många av dessa protokoll antingen odefinierad, feeder baserat hPSCs som utgångsmaterial, eller komplexa, xenogena tillväxtfaktor cocktails för differentiering.
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en robust, optimerad, xeno- och feeder-fri hPSC kultur metod och efterföljande differentiering till hornhinnan LESCs. Enskiktslager kultur av pluripotenta hPSCs på laminin-521 (LN-521) matris i definierade, albumin-fri hPSC medium (särskilt väsentliga 8 Flex) tillåter snabb produktion av homogena utgångsmaterial för differentieringar. Därefter en enkel, two-step differentiering strategi guider hPSCs mot ytan ektodermala öde i suspension, följt av vidhäftande differentiering till LESCs. En cell befolkningen där > 65% uttrycka ΔNp63α erhålls inom 24 dagar. Xeno – och feeder-fri protokollet har testats med flera hPSC linjer (både hESCs och hiPSCs), utan några krav för cell linje specifik optimering. Protokollen för weekend-gratis underhåll, passaging, cryostoring och hPSC-ESF LESC fenotypning beskrivs här möjliggör tillverkning av stora serier av högkvalitativa LESCs för kliniska eller forskningsändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det förväntade resultatet av detta protokoll är framgångsrik och robusta generation av LESCs från en enda cellsuspension av FF hPSC inom cirka 3,5 veckor. Som hornhinneepitelet utvecklas från ytan ektoderm29, syftar det första steget i protokollet till styrning hPSCs mot denna härstamning. En kort 24 h induktion med omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β) antagonist SB-505124 och bFGF används för att framkalla ektodermala differentiering, följt av 48 h mesodermala BMP-4 cue att driva ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien har finansierats av akademin av Finland (licensnummer 297886), det mänskliga reservdelar programmet av Tekes – utvecklingscentralen för teknologi och innovationer, finska ögat vävnad Bank stiftelse och Finska Kulturfonden. Författarna vill tacka de biomedicinska laboratorietekniker Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt och Outi Heikkilä för utmärkt tekniskt bistånd och bidrag till cellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä är erkänt för att tillhandahålla den hiPSC linjen används och BioMediTech Imaging Core facility för att tillhandahålla utrustning för fluorescens avbildning.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
