Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела
Summary
Описал является подготовка антигенной липосомальных наночастиц и их использования в стимулировании B-клетки активации в пробирке и в естественных условиях. Последовательный и надежный антител привело к разработке новой модели арахиса аллергии. Протокол для генерации антигенной липосомы может распространяться на различные антигены и иммунизации модели.
Abstract
Реакции антитела обеспечивают критические защитный иммунитет к широкий спектр патогенных микроорганизмов. По-прежнему существует большой интерес в создании надежной антитела для вакцинации а как понять как патогенные антител реакции развиваются в аллергии и аутоиммунные заболевания. Создание надежной антиген специфические антитела ответы не всегда является тривиальным. В моделях мыши это часто требует нескольких раундов иммунизации с адъювантом, что приводит к большой изменчивости уровня индуцированного антител. Одним из примеров является в моделях мыши аллергии арахиса, где было бы целесообразно более надежных и воспроизводимых моделей, которые сводят к минимуму мыши чисел и использование адъювантов. Представленные здесь представляет собой высокую воспроизводимость мыши модель арахиса аллергии анафилаксии. Эта новая модель основывается на двух ключевых факторов: (1) антиген специфические splenocytes восприимчивую передаются из сенсибилизированных арахисовое мыши в наивной получателей мышь, нормализующее количество антиген специфические памяти – и Т-лимфоцитов через большое количество мышей; и (2) получателя мышей впоследствии увеличила с сильным многовалентных immunogen в виде липосомальных наночастиц, отображение крупных Арахис Аллерген (h 2 Ара). Основным преимуществом этой модели является его воспроизводимости, который в конечном итоге снижает количество животных, используемых в каждом исследовании, при сведении к минимуму количество животных, получать множественные инъекции адъювантной. Модульная сборка этих иммуногенность липосомы обеспечивает относительно легкая адаптируемость к другие аллергические либо аутоиммунные модели, включающие патогенных антител.
Introduction
Пищевая аллергия влияет на 8% детей в Соединенных Штатах и увеличилась в распространенности в последние десятилетия1. Аллергия на арахис влияет на 1% детей и не является обычно перерос2. Хотя несколько перспективных клинические испытания проводятся для лечения пищевой аллергии, включая устное иммунотерапия (ОИТ), сублингвального иммунотерапия (ЩЕЛИ) и иммунотерапия epicutaneous (EPIT), в настоящее время есть нет стратегии лечения, FDA утвержденных для десенсибилизирующее арахиса аллергические люди3,4,5,6,,78. Таким образом аллергические люди должны строго избегать аллергенов, чтобы избежать анафилаксии. Многие вопросы остаются относительно маршрутов сенсибилизации и лежащих в основе механизмов развития пищевой аллергии.
Модели мыши являются ценным инструментом для изучения механизмов аллергии, а также разработки новых tolerogenic и десенсибилизации терапии9,10,,1112. Это особенно верно потому, что крупные Арахис Аллерген (Ара h 2; Ah2) в организме человека также является доминирующей Аллерген в нескольких описал мыши модели,1314. В то время как мыши модели арахиса аллергии являются бесценными в изучении механизмов информирования и терпимости, недостаток заключается в том, что они могут быть переменной и требуют использования адъювантов. Более мощным иммуногенов бы одним из способов минимизировать внутреннюю изменчивость таких моделей. Так как B-клетки активируются сильно многовалентных антигены, антигенных липосомы, отображение Аллерген являются хорошим вариантом из-за их способности потенциально активировать B-клетки через B-клеточного рецептора (BCR), а также имея собственность эффективно Грунтовка отсеке Т-клеток через принимаемые-специфически антиген представляющих клеток.
Здесь мы описываем подробный протокол для спрягать белков антигенов в липосомальных наночастиц с помощью снисходительный и модульной стратегии. Использование суррогатных антиген, анти IgM Fab фрагмента, мы показываем, как мощный, в стимулировании активации B-клеток может быть такой антигенной липосомы. Антигенные липосомы, отображение Ah2 антигена были использованы для разработки новой модели мыши наделяют чувствительности. В этой модели splenocytes от проверенных арахиса аллергия мышей, содержащий памяти – и Т-лимфоцитов, зависящие от ореховое переносятся в наивной congenic мышей. Памяти антител ответы являются индуцированных инъекций липосом, конъюгированных с Ah2 в получателя мышей, с тем чтобы побудить антител против Ah2. Следуют только один импульс с растворимых Ah2 Ah2-специфические антитела порождают сильное анафилактические реакции когда этих мышей впоследствии оспорены с Ah2. Как мышей, проходят аллергические реакции реагирования в весьма единообразно и не получили адъювант, такой подход является желательным арахиса аллергии модель и результаты показывают, что он может иметь утилита в других моделях мыши, движимый антигены, направленных на аллергены и, возможно, autoantigens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные здесь являются общий протокол для сопряжения белка липидов, который позволяет отображать белка на липосомальных наночастиц. Для очень больших мульти Субблок белков этот протокол может ограниченную полезность. Идеальный метод должен быть введение конкретных тег, кот…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов от министерства обороны (W81XWH-16-1-0302 и W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
