प्रतिजनी रोग-विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए Liposomes
Summary
वर्णित प्रतिजनी liposomal नैनोकणों और इन विट्रो में और vivoमें उत्तेजक बी सेल सक्रियण में उनके उपयोग की तैयारी है । लगातार और मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं एक नई मूंगफली एलर्जी मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया । प्रतिजनी liposomes पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल अलग प्रतिजनों और प्रतिरक्षण मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Abstract
एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं रोगजनकों की एक विस्तृत सरणी के लिए महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रदान करते हैं । वहां टीकाकरण के लिए मजबूत एंटीबॉडी पैदा करने में एक उच्च ब्याज के रूप में अच्छी तरह के रूप में समझ कैसे रोगजनक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं एलर्जी और स्व-प्रतिरक्षित रोग में विकसित रहता है । मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं पैदा हमेशा तुच्छ नहीं है । माउस मॉडलों में, यह अक्सर सहायक के साथ प्रतिरक्षण के कई दौर की आवश्यकता है कि प्रेरित एंटीबॉडी के स्तर में परिवर्तनशीलता का एक बड़ा सौदा होता है । एक उदाहरण मूंगफली एलर्जी के माउस मॉडल में है, जहां अधिक मजबूत और reproducible मॉडल है कि माउस की संख्या को कम करने और सहायक के उपयोग के लिए फायदेमंद होगा । यहां प्रस्तुत मूंगफली एलर्जी तीव्रग्राहिता का एक अत्यधिक reproducible माउस मॉडल है । इस नए मॉडल दो प्रमुख कारकों पर निर्भर करता है: (1) प्रतिजन-विशिष्ट splenocytes एक भोली प्राप्तकर्ता माउस में एक मूंगफली-संवेदी माउस से स्थानांतरित adoptively रहे हैं, प्रतिजन की संख्या-विशिष्ट स्मृति बी और चूहों की एक बड़ी संख्या में टी कोशिकाओं को सामांय; और (2) प्राप्तकर्ता चूहों बाद में प्रमुख मूंगफली एलर्जी (आरा एच 2) प्रदर्शित liposomal नैनोकणों के रूप में एक मजबूत multivalent immunogen के साथ बढ़ाया जाता है । इस मॉडल का प्रमुख लाभ अपने reproducibility है, जो अंततः प्रत्येक अध्ययन में इस्तेमाल जानवरों की संख्या कम करती है, जबकि सहायक के कई इंजेक्शन प्राप्त पशुओं की संख्या को कम । इन immunogenic liposomes के मॉड्यूलर विधानसभा अंय एलर्जी या स्व-प्रतिरक्षित मॉडल है कि रोगजनक एंटीबॉडी शामिल करने के लिए अपेक्षाकृत सतही अनुकूलन प्रदान करता है ।
Introduction
खाद्य एलर्जी संयुक्त राज्य अमेरिका में बच्चों के 8% को प्रभावित करता है, और पिछले एक दशक से अधिक प्रसार में वृद्धि हुई है1। मूंगफली से एलर्जी बच्चों के 1% को प्रभावित करता है और आम तौर पर2से अधिक नहीं हो । हालांकि कई होनहार नैदानिक परीक्षण खाद्य एलर्जी के उपचार के लिए चल रहे हैं, मौखिक immunotherapy सहित (OIT), मांसल immunotherapy (भट्ठा), और epicutaneous immunotherapy (एपिट), वहां वर्तमान में कोई एफडीए-उपचार रणनीतियों को मंजूरी दे दी है मूंगफली-एलर्जी व्यक्तियों3,4,5,6,7,8को संवेदनशील बनाना । इसलिए, एलर्जी व्यक्तियों कड़ाई से एलर्जी तीव्रग्राहिता से बचने के लिए बचना चाहिए । कई सवाल संवेदीकरण और खाद्य एलर्जी विकास के अंतर्निहित तंत्र के मार्गों के बारे में रहते हैं ।
माउस मॉडल एलर्जी के तंत्र के अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नए tolerogenic और संवेदी उपचार9,10,11,12के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यह विशेष रूप से सच है क्योंकि प्रमुख मूंगफली एलर्जी (आरा एच 2; Ah2) मनुष्यों में भी है प्रमुख एलर्जी में कई वर्णित माउस13,14मॉडल । जबकि मूंगफली एलर्जी के माउस मॉडल संवेदीकरण और सहिष्णुता के तंत्र का अध्ययन करने में अमूल्य हैं, एक खामी यह है कि वे चर और adjuvants के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है । अधिक शक्तिशाली immunogens एक तरह से इस तरह के मॉडल के आंतरिक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए किया जाएगा । के बाद से बी-कोशिकाओं दृढ़ता से सक्रिय है multivalent एंटीजन, प्रतिजनी प्रदर्शित liposomes एलर्जी की वजह से बी सेल रिसेप्टर (BCR) के माध्यम से संभावित ख कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता का एक अच्छा विकल्प है जबकि भी कुशलता की संपत्ति होने के माध्यम से टी सेल डिब्बे भड़काने गैर विशेष रूप से प्रतिजन प्रस्तुत कोशिकाओं द्वारा लिया जा रहा है ।
यहां, हम conjugating प्रोटीन एंटीजन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक सतही और मॉड्यूलर रणनीति का उपयोग नैनोकणों liposomal । एक किराए प्रतिजन, विरोधी आईजीएम फैब टुकड़ा का उपयोग कर, हम प्रदर्शन कैसे शक्तिशाली ऐसे प्रतिजनी liposomes बी में उत्तेजक हो सकता है-सेल सक्रियण । antigen liposomes प्रदर्शित Ah2 प्रतिजन लिटरेचर संवेदनशीलता का एक नया माउस मॉडल को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया । इस मॉडल में, सत्यापित मूंगफली एलर्जी चूहों से splenocytes, मूंगफली विशिष्ट स्मृति बी और टी कोशिकाओं युक्त, भोले congenic चूहों में स्थानांतरित कर रहे हैं । स्मृति एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं Ah2 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रेरित करने के क्रम में, प्राप्तकर्ता चूहों में Ah2 के साथ liposomes संयुग्मित के इंजेक्शन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. घुलनशील Ah2 के साथ केवल एक को बढ़ावा देने के बाद, Ah2-विशिष्ट एंटीबॉडी जब इन चूहों बाद में Ah2 के साथ चुनौती दी है एक मजबूत anaphylactic प्रतिक्रिया को जन्म दे । के रूप में एक अत्यधिक समान तरीके से एलर्जी प्रतिक्रिया के दौर से गुजर चूहों और एक सहायक प्राप्त नहीं किया है, इस दृष्टिकोण एक वांछनीय मूंगफली एलर्जी मॉडल है और परिणामों का सुझाव है कि यह अन्य माउस पर निर्देशित एंटीजन द्वारा संचालित मॉडल में उपयोगिता हो सकती है एलर्जी और संभवत: एंटीजन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां उल्लिखित विधियों में से एक प्रोटीन के विकार के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है एक लिपिड जो liposomal नैनोकणों पर प्रोटीन के प्रदर्शन को सक्षम बनाता है. बहुत बड़ी बहु-उप इकाई प्रोटीन के लिए, इस प्रोटोकॉल सीमि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को रक्षा विभाग (W81XWH-16-1-0302 और W81XWH-16-1-0303) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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