Summary

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.

Abstract

Respuestas de anticuerpos proporcionan inmunidad protectora crítica a una amplia gama de patógenos. Existe un gran interés en la generación de anticuerpos robustos para la vacunación, así como entender cómo patógeno anticuerpo respuestas desarrollan alergias y enfermedades autoinmunes. Generar respuestas de anticuerpos específicos del antígeno robusta no es siempre trivial. En modelos de ratón, a menudo requiere múltiples rondas de inmunización con adyuvante que conduce a una gran cantidad de variabilidad en los niveles de anticuerpos inducidos. Un ejemplo es en modelos de ratón de alergia a los cacahuates en modelos más robustos y reproducibles que minimicen el número de ratón y el uso de adyuvante sería beneficiosos. Presentado aquí es un modelo de ratón altamente reproducible de anafilaxis alergia del cacahuete. Este nuevo modelo se basa en dos factores clave: (1) específica de antígeno esplenocitos eventualmente se transfieren de un ratón sensibilizado de maní en un ratón receptor ingenuo, normalizando la cantidad de memoria específica de antígeno las células B y T a través de un gran número de ratones; y ratones receptores (2) posteriormente se refuerzan con un fuerte inmunógeno multivalente en forma de nanopartículas liposómicos mostrando el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2). La gran ventaja de este modelo es su reproducibilidad, que en última instancia, disminuye el número de animales utilizados en cada estudio, al tiempo que minimiza el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante. El montaje modular de estos liposomas inmunogénicas proporciona relativamente fácil adaptabilidad a otros modelos alérgicas o autoinmunes que involucran anticuerpos patógenos.

Introduction

La alergia alimentaria afecta al 8% de los niños en los Estados Unidos y prevalencia se ha incrementado en los últimos decenio1. Alergia al maní afecta a 1% de los niños y no es típicamente pequeño2. Aunque varios prometedores ensayos clínicos están en marcha para el tratamiento de la alergia alimentaria, incluyendo inmunoterapia oral (OIT), la inmunoterapia sublingual (SLIT) y epicutánea inmunoterapia (EPIT), actualmente no hay estrategias de tratamiento aprobado por la FDA para individuos alérgicos a cacahuete3,4,5,6,7,8de desensibilización. Por lo tanto, personas alérgicas deben evitar estrictamente los alergenos para evitar la anafilaxia. Quedan muchos interrogantes en cuanto a vías de sensibilización y subyacente a los mecanismos de desarrollo de alergia alimentaria.

Modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de la alergia, así como desarrollar nuevos tolerogénicas y desensibilización terapias9,10,11,12. Esto es particularmente cierto porque el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2; Ah2) en seres humanos es también el alergeno dominante en varios descrito ratón modelos13,14. Mientras que los modelos de ratón de la alergia del cacahuete son invaluables en el estudio de los mecanismos de sensibilización y tolerancia, una desventaja es que puede ser variable y requieren el uso de adyuvantes. Inmunógenos más potente sería una forma de minimizar la variabilidad intrínseca de dichos modelos. Puesto que las células de B son fuertemente activadas por antígenos multivalentes, liposomas antigénicas mostrando el alérgeno son una buena opción debido a su capacidad para potencialmente activar células B a través de los receptores de células B (BCR) mientras que también tiene la propiedad de manera eficiente el compartimiento de las células T a través de ser tomado no específica de antígeno-presentación de cebado las células.

Aquí, describimos un protocolo detallado para antígenos de la proteína a la nanopartículas mediante una estrategia modular y fácil de conjugar. Utilizando un antígeno de suplente, fragmento Fab de anti-IgM, demostramos cómo potente estos liposomas antigénicas pueden ser en la activación de células B estimulante. Liposomas antigénicas con Ah2 antígeno fueron usados para desarrollar un nuevo modelo de ratón de confiere sensibilidad. En este modelo, los esplenocitos de ratones alérgicas cacahuetes verificadas, que contienen cacahuete específica memoria células B y T, se transfieren a ratones Congénicos de ingenuo. Inyección de liposomas conjugados con Ah2 en los ratones receptores, con el fin de inducir anticuerpos contra Ah2 induce respuestas de anticuerpos de memoria. Seguido por un único impulso con Ah2 soluble, anticuerpos específicos Ah2 dan lugar a una fuerte respuesta anafiláctica cuando estos ratones son desafiados posteriormente con Ah2. Ratones sometidos a la reacción alérgica responden de manera más uniforme y no han recibido un adyuvante, este enfoque es un modelo de alergia del cacahuete deseable y los resultados sugieren que puede tener utilidad en otros modelos de ratón impulsados por antígenos dirigidos a alérgenos y posiblemente autoantígenos.

Protocol

El método general de acoplamiento proteína lípidos y incorporar en liposomas se basa en gran parte en trabajo anterior15. Todos los procedimientos animales descritos a continuación han sido aprobados por la Universidad de Carolina del norte en la colina de la capilla institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Todos los ratones utilizados en el modelo de la alergia del cacahuete son hembras BALB/cJ compradas de 3 semanas de edad. El cuidado Animal de la Universidad de Alberta y el Comi…

Representative Results

Conjugación de la proteína de interés con DSPE-PEG(2000) puede demostrar ejecutando una reducción mostrando un incremento en el peso molecular en comparación con la proteína no conjugada. Figura 1A muestra un gel representante de conjugación de fragmento de anti-ratón IgM F(ab) PEG-DSPE, que muestra un bandshift de 2 – 3 kDa de la proteína desnaturalizada. Tenga en cuenta que aproximadamente el 50% de la proteína parece ser modificado, que se espe…

Discussion

Los métodos descritos aquí son un protocolo general para la conjugación de una proteína a un lípido que permite la visualización de la proteína en nanopartículas liposómicos. Para proteínas de multi-subunidades muy grandes, este protocolo puede haber limitado utilidad. El método ideal sería la introducción de una etiqueta específica que permite una estrategia de enlace químico biorthogonal ser utilizado. Si expresan la proteína por vía recombinante, esto puede ser posible utilizando estrategias específi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por becas del Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0302 y W81XWH-16-1-0303).

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

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Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

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