Liposomes antigéniques pour la production d’anticorps spécifiques à certaines maladies
Summary
Décrit est la préparation de nanoparticules LIPOSOMALES antigéniques et leur utilisation en stimulant cellules B activation in vitro et in vivo. Uniforme et robuste d’anticorps conduit à l’élaboration d’un nouveau modèle d’allergie à l’arachide. Le protocole pour générer des liposomes antigéniques peut être étendu à des antigènes différents et des modèles de vaccination.
Abstract
Les réponses anticorps fournissent une immunité protectrice critique à un large éventail d’agents pathogènes. Il reste un grand intérêt dans la production d’anticorps robustes pour la vaccination ainsie que de comprendre comment pathogènes anticorps réponses se développent dans les allergies et les maladies auto-immunes. Génération d’anticorps spécifiques de l’antigène robuste n’est pas toujours trivial. Dans des modèles murins, il nécessite souvent plusieurs séries de vaccins avec adjuvant qui mène à une grande variabilité dans les niveaux d’anticorps induits. Un exemple est dans des modèles murins d’allergies aux arachides, où les modèles plus robustes et reproductibles qui réduisent au minimum le nombre de souris et l’utilisation de l’adjuvant serait bénéfiques. Présenté ici est un modèle de souris hautement reproductible de l’anaphylaxie de l’allergie à l’arachide. Ce nouveau modèle s’appuie sur deux facteurs : (1) spécifiques de l’antigène splénocytes sont Moutschen transférés d’une souris sensibilisés à l’arachide dans une souris destinataire naïf, normalisant le nombre de mémoire spécifiques de l’antigène B et T-cellules dans un grand nombre de souris ; et (2) souris bénéficiaires sont amplifiées par la suite avec un immunogène multivalent solide sous forme de nanoparticules LIPOSOMALES affichant le principal allergène d’arachide (Ara h 2). L’avantage majeur de ce modèle est sa reproductibilité, qui réduit en fin de compte le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude, tout en minimisant le nombre d’animaux ayant reçu de multiples injections d’adjuvant. L’Assemblée modulaire de ces liposomes immunogènes fournit une adaptabilité relativement facile à d’autres modèles allergiques ou auto-immunes qui impliquent des anticorps pathogènes.
Introduction
Allergie alimentaire touche 8 % des enfants aux Etats-Unis et a augmenté dans la prévalence au cours de la dernière décennie1. Allergie à l’arachide affecte 1 % des enfants et n’est pas généralement dépassé2. Bien que plusieurs essais cliniques prometteuses sont en cours pour le traitement des allergies alimentaires, y compris l’immunothérapie par voie orale (OIT), l’immunothérapie sublinguale (fente) et immunothérapie épicutanée (romaric), il n’y a actuellement pas de stratégies de traitement approuvé par la FDA pour la désensibilisation des personnes allergiques aux arachides3,4,5,6,7,8. Donc, les personnes allergiques doivent éviter strictement allergènes afin d’éviter l’anaphylaxie. De nombreuses questions restent en ce qui concerne les voies d’une sensibilisation et qui sous-tendent les mécanismes du développement d’allergie alimentaire.
Les modèles de souris sont un outil précieux pour étudier les mécanismes de l’allergie ainsi que le développement de nouveaux tolérogène et désensibilisation thérapies9,10,11,12. Cela est particulièrement vrai parce que le principal allergène d’arachide (Ara h 2 ; Ah2) chez l’homme est aussi décrit de l’allergène dominante dans plusieurs souris modèles13,14. Alors que les modèles murins d’allergie à l’arachide ont une valeur inestimables pour l’étude des mécanismes de sensibilisation et de la tolérance, un inconvénient est qu’ils peuvent être variables et nécessitent l’utilisation d’adjuvants. Immunogènes plus puissant serait une façon de réduire la variabilité intrinsèque de ces modèles. Étant donné que les lymphocytes B sont fortement activées par des antigènes multivalents, liposomes antigéniques affichant l’allergène sont une bonne option en raison de leur capacité à activer potentiellement lymphocytes B par le récepteur des cellules B (BCR) tout en ayant également la propriété de façon efficace amorçage du compartiment de lymphocytes par non spécifiquement que présentatrices d’antigène des cellules.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la conjugaison des antigènes protéiques aux nanoparticules LIPOSOMALES en utilisant une stratégie modulaire et facile. En utilisant un antigène de substitution, les IgM anti-fragment Fab, nous démontrons comment puissant ces liposomes antigéniques peuvent être dans l’activation des lymphocytes B stimulante. Liposomes antigéniques affichant Ah2 antigène ont servi à élaborer un nouveau modèle de souris de sensibilité conféré. Dans ce modèle, splénocytes de vérifié souris allergiques aux arachides, contenant les mémoires d’arachide-spécifiques et T-lymphocytes B, sont transférés dans la souris congéniques naïves. Réponses d’anticorps de mémoire sont induites par l’injection de liposomes conjugués avec Ah2 dans les souris bénéficiaires, afin d’induire des anticorps contre Ah2. Suivi par seulement un coup de pouce Ah2 soluble, anticorps spécifiques Ah2 donnent lieu à une forte réaction anaphylactique lors de ces souris sont subséquemment contestés avec Ah2. Souris en cours de la réaction allergique répondent de manière très uniforme et n’ont pas reçu un adjuvant, cette approche est un modèle d’allergie à l’arachide souhaitable et les résultats suggèrent qu’il pourrait avoir utilité dans d’autres modèles de souris conduits par dirigée contre des antigènes allergènes et éventuellement les auto-antigènes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ici sont un protocole général pour la conjugaison d’une protéine à un lipide qui permet l’affichage de la protéine sur les nanoparticules LIPOSOMALES. Pour les très grands plusieurs sous-unités protéiques, ce protocole peut avoir une utilité limitée. La méthode idéale serait l’introduction d’une balise spécifique au site qui permet une stratégie de liaison chimique établies à utiliser. S’exprimant la protéine inoculation, cela peut être possible à l’aide de stratégi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des subventions du ministère de la défense (W81XWH-16-1-0302 et W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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