Spontant kontraherende syncytia af cardiomyocytes stammer fra menneskelige-induceret pluripotente er stamceller nyttige modeller af menneskers hjerte fysiologi og farmakologi. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed screening system for at kvantificere virkningerne af udefrakommende forbindelser på slå frekvens, ved hjælp af et Ca-følsomme fluorescerende farvestof og en temperatur-kontrolleret imaging multi godt Pladelæser.
Spontant kontraherende syncytia af cardiomyocytes stammer fra menneskelige-induceret pluripotente er stamceller (hiPSC-CM) en nyttig model af menneskets hjerte fysiologi og farmakologi. Forskellige metoder er blevet foreslået til at registrere denne spontane aktivitet og for at vurdere narkotika effekter, men mange af disse metoder lider begrænset overførselshastighed og/eller fysiologiske relevans. Vi udviklet en høj overførselshastighed screening system for at kvantificere virkningerne af udefrakommende forbindelser på hiPSC-CMS bankende frekvens, ved hjælp af et Ca-følsomme fluorescerende farvestof og en temperatur-kontrolleret imaging multi godt Pladelæser. Vi beskriver hvordan man forbereder celle plader og de sammensatte plader og hvordan man køre automatiserede analysen for at opnå høj følsomhed og reproducerbarhed. Vi beskriver også hvordan til at omdanne og analysere fluorescens data for at give pålidelige foranstaltninger af narkotika virkninger på spontan rytme. Denne analyse kan bruges i drug discovery programmer til at guide kemiske optimering væk fra eller mod, stoffer der påvirker menneskelige hjertefunktion.
Denne protokol skildrer en metode til at måle lægemiddel virkninger på den spontane slå hyppigheden af syncytia af hiPSC-CM på fysiologisk relevante rytmer. Human-induceret pluripotente stamceller kan udvikle sig til funktionelle cardiomyocytes, der etablerer spontant bankende syncytia in vitro-1,2,3,4. Disse hiPSC-CM fås i stort tal gennem kommercielle udbydere eller produktion i laboratoriet, og de er en nyttig kilde til celler til at generere modeller af menneskers hjerte fysiologi og farmakologi. De kan især bruges til at forudsige eller at karakterisere hjerte virkninger, der kan opstå, når et stof indgives til mennesker5.
Slå hyppigheden af hiPSC-CM syncytia kan måles på fysiologiske betingelser ved hjælp af mikroelektrode arrays eller impedans sensing1: disse noninvasive teknikker give meget detaljerede oplysninger om narkotika virkninger, men de er snarere lav-overførselshastighed, og de sætter ikke teste store sammensatte biblioteker i realistisk tid og budgetbegrænsninger. Et mere effektivt system kan blive udarbejdet ved hjælp af en 384-godt fluorescens imaging Pladelæser og en Ca-følsomme farvestof6, men klassisk plade læsere er hæmmet af suboptimal temperatur kontrol og erhvervelse frekvens. Disse begrænsninger er illustreret af unphysiological slå satser (~ 15 bpm, sammenlignet med 35-55 bpm i kontrollerede miljøer1) og dårlig Ca signal opløsning (en erhvervelse frekvens på 8 Hz er på den nedre grænse til optage satser, der kan nå 120 bpm stimuleret betingelser, og det kan ikke udtrække oplysninger såsom hældning eller varighed). Metoden beskrevet her kombinerer optagelse for at slå mønstre på fysiologiske rytmer og tilstrækkelig opløsning til hinder for disse bekymringer.
På den positive side er denne metode simpel, pålidelig og høj overførselshastighed, som tillader hurtig test af stort antal forbindelser til en fornuftig pris. På den negative side, denne metode kræver en hurtig Pladelæser med effektive temperaturkontrol, som er en kostbar investering, og det giver lidt mekanistiske information om observerede narkotika virkninger, som kan nødvendiggøre yderligere prøvning med mere detaljerede metoder.
Ca 6 x 106 hiPSC-CM er behov for en måling i en 384-godt celle plade. hiPSC-CM leveres normalt kommercielt som frosne delprøver af ~ 4 x 106 celler i 1 mL. Derfor er det bekvemt at forberede to celle plader med tre frosne delprøver. I de fleste tilfælde på grund af den lave variation af denne analyse, er det tilstrækkeligt at udføre identiske målinger af test forbindelser og, i hver celle plade, forsøgsbetingelse målinger af de positive kontroller (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin og E-4031), og 20-plicate målinger af den negative kontrol (DMSO alene). Derfor kan højst 352 sammensatte/koncentration par evalueres med to 384-godt cellen plader. Følgende protokol finder sådan et eksperiment udført med 352 test forbindelser, to celle plader og 12 millioner celler leveres som tre frosne delprøver; Det kan være let skaleres op, hvis flere datapunkter er nødvendige.
To aspekter er mest afgørende for en vellykket optagelse i slå frekvenser. Først er at udvise forsigtighed med celle plating og kultur. Det er især vigtigt at forsøge at undgå at ridse cellelag i bunden af brøndene når udveksling medium. Det er acceptabelt at røre bunden af brøndene med pipetter, men den samme vinkel bør anvendes hver gang dermed producerer kun en lille skramme i cellelag og ikke påvirke assay ydeevne. Det andet kritiske aspekt for at opnå reproducerbare homogene rytmer er at give god temperaturkontrol ved 37 ° C i hele cellen plade for varigheden af målingen. Vi kunne ikke opnå denne ensartethed ved hjælp af andre enheder end i pladelæseren anvendes her, men det kan være muligt med særlige ændringer til forordningen temperatur: det ville gøre den protokol, der præsenteres her mere bredt anvendelige ud over et enkelt mærke af plade læser. For at opnå temperatur stabilitet for varigheden af forsøget med den enhed, der bruges her, var det nødvendigt at stoppe hver optagelse før det endte; ellers, robotten ville skubbe den målte celle plade. Dette tekniske problem kan forsvinde med den næste udgave af softwaren til læseren til pladen, men det er fortsat afgørende for nu. Hvis en celle plade er fejlagtigt overført udenfor i pladelæseren, skal det være lastet tilbage inde så hurtigt som muligt. Ikke desto mindre, kvaliteten af eksperimentet vil forværres, fordi temperaturændringer påvirker slå sats meget hurtigt.
Nogle andre aspekter, der ikke er er blevet testet grundigt, kan være mindre vigtigt. For eksempel, hiPSC-CM producenter anbefaler belægning cellekultur plader før såning cellerne, men i denne konkrete analyse, belægning blev ikke brugt, fordi cellerne overholde ganske let på forskellige overflader, og det er meget svært at korrekt frakke 384-godt plader. Endnu, celle plade belægning kan stadig være tilladte, eller det kan endda forbedre assay kvalitet. Vi testede også aldrig om opløsningsmidler end DMSO ville være acceptabel, men det forventes fra erfaring med andre teknologier, optagelse, at lignende koncentrationer af EtOH eller MeOH også ville være acceptabel. Generelt bruger vi hiPSC-CMs fra samme producent, og celler fra kun én ekstra leverandør blev testet, som syntes at arbejde på en lignende måde. Ligeledes har vi brugt kun et lille antal forskellige batches af hiPSC-CMs, der blev valgt ved prechecking dem til at kontrollere, at de opførte sig på samme måde til den første gruppe. En eller to partier blev anset for uhensigtsmæssigt, fordi deres syncytia havde dårlig stabilitet eller reproducerbarhed betingelser kultur anvendes her. Ellers, farmakologi syntes meget ens på tværs af partier når du tester et begrænset panel af “typiske” forbindelser (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin, og E-4031, samt endothelin, isoprenalin, amlodipin og ponesimod). Vi brugte kun hiPSC-CM stammer fra raske donorer. Det kan være umagen værd at vurdere, om hiPSC-CM stammer fra patienter med hjertesygdomme ville give forskellige resultater, selv om ingen forskel mellem raske donorer og patienter blev observeret ved vurderingen af cardiotoxicity af tyrosin kinase hæmmere 12. Endelig, vi normalt vente 22-28 dage i kultur før måling narkotika effekter: vores erfaring med impedans optagelser af de samme celler, en steady-state for langsom impedans (en indikator for celle lag stabilitet) og hurtig impedans (en indikator for slå frekvens) nås efter 12–15 dage i kultur. Dog besluttede vi at vente 22–28 dage, fordi det er den tid, når profilen udtryk af cardiac kanaler og modning markører er stabiliseret13. Det var ikke undersøgt, om sammenlignelige resultater ville kunne opnås, hvis cellerne blev brugt tidligere eller senere.
Protokollen beskrev bruger her en meget ligetil måling af den spontane slå sats på hiPSC-CM til at vurdere potentielle lægemiddel virkninger på menneskers hjerte Elektrofysiologi. Dets vigtigste fordele i forhold til andre metoder er at i) det er indstillet til en høj overførselshastighed screening miljø, ii) det registrerer aktiviteten af cardiomyocytes og virkningerne af narkotika på fysiologiske temperaturer, og iii) det kræver ikke elektrofysiologiske ekspertise til udførelse eller for en vurdering af resultaterne.
I en valideringsundersøgelse udført med mange lægemidler godkendt til human brug, viste vi, at analysen reagerer på lægemidler, der anvendes i human medicin som forudsagt af eksisterende kliniske data5. Fordi denne metode finder alle potentielle virkninger på hjerterytmen, supplerer det den omfattende i vitro Proarrhythmic analyse (CiPA) initiativ14 der specifikt vurderer pro-arytmi potentiale.
Fremover vil kunne denne metode give en yderligere forståelse af tilstanden af handling af stoffer vist sig at påvirke den spontane slå. Det er sandsynligt, at yderligere mekanistiske information er til stede i fluorescens optagelser af Ca transienter (f.eks.i deres amplitude eller figur). Hvis fluorescens optagelser er udført til højere erhvervelse priser (fx, 30 Hz), disse parametre pakkes nemt ud over slå sats, og det kan være interessant at korrelere ændringer i disse parametre med de kendte virkninger af klinisk brugt stoffer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen anerkendelser.
FDSS7000 fluorescent plate reader | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
not a catalog item | |
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
installed initially in the device |
|
FDSS7000 temperature control | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A10118-09 | |
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
C11653-11 | |
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A8687-62 | |
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
U8524-12 | optional alternative to the Igor Pro software |
Igor Pro data analysis software | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) |
Latest version | |
iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | includes cells, plating and maintenance media |
Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (Cologne, Germany) |
Ax-B-HC02-4M | includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes |
384-well cell culture plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
384-well compound plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) |
R8142 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
F6886 | |
N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
C8031 | |
E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) |
BML-KC158 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15140-122 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15250061 |