सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव हृदय फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के उपयोगी मॉडल हैं । यहाँ हम धड़कन आवृत्ति पर exogenous यौगिकों के प्रभाव यों तो एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली वर्तमान, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर.
सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC-सेमी) से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान का एक उपयोगी मॉडल हैं । विभिंन तरीकों के लिए इस सहज गतिविधि रिकॉर्ड और नशीली दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन इन तरीकों के कई सीमित प्रवाह से ग्रस्त है और/ हम एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली विकसित करने के लिए hiPSC पर exogenous यौगिकों के प्रभाव-मुख्यमंत्री की पिटाई आवृत्ति, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर । हम कैसे सेल प्लेटें और यौगिक प्लेटें तैयार करने के लिए और कैसे उच्च संवेदनशीलता और reproducibility प्राप्त करने के लिए स्वचालित परख चलाने के लिए वर्णन । हम यह भी वर्णन कैसे प्रतिदीप्ति डेटा को बदलने और विश्लेषण करने के लिए सहज लय पर नशीली दवाओं के प्रभाव के विश्वसनीय उपाय प्रदान करते हैं । इस परख दवा खोज कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता से दूर रासायनिक अनुकूलन गाइड, या की ओर, मानव हृदय समारोह को प्रभावित यौगिकों ।
वर्तमान प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक लय में hiPSC के syncytia की सहज धड़कन आवृत्ति पर दवा प्रभाव को मापने के लिए एक विधि को दर्शाया गया है. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं कार्यात्मक cardiomyocytes है कि सहज इन विट्रो1,2,3,4में syncytia धड़कन की स्थापना में अंतर कर सकते हैं । इन hiPSC-सेमी बड़ी संख्या में वाणिज्यिक प्रदाताओं के माध्यम से या प्रयोगशाला में उत्पादन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, और वे कोशिकाओं का एक उपयोगी स्रोत मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के मॉडल उत्पन्न कर रहे हैं. विशेष रूप से, वे भविष्यवाणी करने के लिए या हृदय प्रभाव है कि जब एक दवा मनुष्यों5के लिए प्रशासित किया जाता है हो सकता है की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
hiPSC की धड़कन आवृत्ति-सेमी syncytia microelectrode arrays या1संवेदन प्रतिबाधा का उपयोग शारीरिक स्थितियों के तहत मापा जा सकता है: इन गैर इनवेसिव तकनीक दवा प्रभाव पर बहुत विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन वे कर रहे हैं बल्कि कम प्रवाह और वे यथार्थवादी समय और बजट की कमी के भीतर बड़े यौगिक पुस्तकालयों परीक्षण सक्षम नहीं है । एक अधिक प्रभावी प्रणाली एक ३८४-अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्लेट रीडर और एक Ca-संवेदनशील डाई6का उपयोग कर सविस्तार किया जा सकता है, लेकिन शास्त्रीय प्लेट पाठकों को इष्टतम तापमान नियंत्रण और अधिग्रहण आवृत्ति द्वारा रुकावट हैं । इन सीमाओं को दैहिक धड़कन दर से सचित्र (~ 15 bpm, 35 की तुलना में कर रहे है-55 नियंत्रित वातावरण में bpm1) और गरीब Ca संकेत संकल्प (8 हर्ट्ज की एक अधिग्रहण आवृत्ति के लिए कम सीमा पर है रिकॉर्ड दरों कि तक पहुंच सकते है १२० bpm उत्तेजित शर्तों के अंतर्गत, और यह जानकारी जैसे प्रवणता या अवधि नहीं निकाल सकता) । विधि यहां वर्णित शारीरिक लय में पिटाई पैटर्न की रिकॉर्डिंग को जोड़ती है और पर्याप्त संकल्प पर इन चिंताओं को बाधा ।
सकारात्मक पक्ष पर, इस विधि सरल, विश्वसनीय है, और उच्च प्रवाह, जो उचित मूल्य पर यौगिकों की बड़ी संख्या के तेजी से परीक्षण की अनुमति देता है । नकारात्मक पक्ष पर, इस विधि प्रभावी तापमान नियंत्रण है, जो एक महंगा निवेश है के साथ एक तेज प्लेट रीडर की आवश्यकता है, और यह मनाया दवा प्रभाव है, जो और अधिक विस्तृत के साथ आगे परीक्षण जरूरत सकता है पर थोड़ा यंत्रवत जानकारी प्रदान करता है विधियों.
Approximatively 6 x 106 hiPSC-CM १ ३८४-well सेल प्लेट में एक माप के लिए आवश्यक हैं । hiPSC-सेमी आमतौर पर 1 मिलीलीटर में ~ 4 x 106 कोशिकाओं के जमे हुए aliquots के रूप में वाणिज्यिक आपूर्ति कर रहे हैं । इसलिए, यह तीन जमे हुए aliquots के साथ दो सेल प्लेट तैयार करने के लिए सुविधाजनक है । ज्यादातर मामलों में, इस परख की कम परिवर्तनशीलता के कारण, यह परीक्षण यौगिकों के डुप्लिकेट माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है और, प्रत्येक कोशिका थाली में, सकारात्मक नियंत्रण के quadruplicate माप (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१), और 20-नकारात्मक नियंत्रण के plicate माप (अकेले DMSO) । इसलिए, ३५२ यौगिक/एकाग्रता जोड़े की एक अधिकतम २ ३८४-well सेल प्लेट के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । निंन प्रोटोकॉल मानता है कि इस तरह के एक प्रयोग ३५२ परीक्षण यौगिकों, दो सेल प्लेटें, और १२,०००,००० तीन जमे हुए aliquots के रूप में आपूर्ति की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया; यदि अतिरिक्त डेटा बिंदुओं की आवश्यकता हो तो इसे आसानी से स्केल किया जा सकता है ।
दो पहलुओं की धड़कन आवृत्तियों की सफल रिकॉर्डिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं. पहले सेल चढ़ाना और संस्कृति के साथ सावधानी बरतें । विशेष रूप से, यह प्रयास करने के लिए और माध्यम का आदान प्रदान जब कुओं के तल पर सेल परत scratching से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यह पिपेट के साथ कुओं के नीचे छूने के लिए स्वीकार्य है, लेकिन एक ही कोण हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जिससे सेल परत में केवल एक छोटे खरोंच उत्पादन और परख प्रदर्शन को प्रभावित नहीं । reproducible सजातीय लय प्राप्त करने का दूसरा महत्वपूर्ण पहलू माप की अवधि के लिए सेल प्लेट भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर अच्छा तापमान नियंत्रण प्रदान करने के लिए है । हम इस एकरूपता थाली पाठक के अलावा अंय उपकरणों का उपयोग कर प्राप्त नहीं कर सकता यहां इस्तेमाल किया, लेकिन यह तापमान विनियमन के लिए विशेष संशोधनों के साथ संभव हो सकता है: यह प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाएगा और अधिक मोटे तौर पर थाली का एक ब्रांड से परे प्रयोग करने योग्य रीडर. यहाँ प्रयुक्त डिवाइस के साथ प्रयोग की अवधि के लिए तापमान स्थिरता प्राप्त करने के लिए, यह एक रिकॉर्डिंग समाप्त होने से पहले बंद करने के लिए आवश्यक था; अंयथा, रोबोट मापा सेल प्लेट बेदखल होगा । इस तकनीकी मुद्दे प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के अगले रिलीज के साथ गायब हो सकता है, लेकिन यह अब के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है । यदि एक सेल प्लेट गलती से प्लेट रीडर के बाहर स्थानांतरित कर दिया है, यह वापस के रूप में संभव के रूप में तेजी से अंदर लोड किया जाना चाहिए । फिर भी, प्रयोग की गुणवत्ता खराब हो जाएगी, क्योंकि तापमान परिवर्तन धड़कन दर को बेहद तेजी से प्रभावित करते हैं ।
कुछ अंय पहलुओं, जो अच्छी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है, कम महत्वपूर्ण हो सकता है । उदाहरण के लिए, hiPSC-मुख्यमंत्री निर्माताओं की कोशिकाओं को बोने से पहले कोटिंग सेल संस्कृति प्लेट की सिफारिश, लेकिन इस विशिष्ट परख में, कोटिंग इस्तेमाल नहीं किया गया था, क्योंकि कोशिकाओं विभिन्न सतहों पर काफी आसानी से पालन, और यह ठीक से बहुत मुश्किल है कोट ३८४-अच्छी तरह से प्लेटें. अभी तक, सेल प्लेट कोटिंग अभी भी स्वीकार्य हो सकता है, या यह भी परख गुणवत्ता में सुधार हो सकता है । हम यह भी परीक्षण किया कि सॉल्वैंट्स DMSO के अलावा अंय स्वीकार्य होगा कभी नहीं, लेकिन यह अंय रिकॉर्डिंग प्रौद्योगिकियों कि ेतोः या MeOH के समान सांद्रता भी संतोषजनक होगा के साथ अनुभव से उंमीद है । हम आम तौर पर एक ही निर्माता से hiPSC सीएमएस का उपयोग करें, और केवल एक अतिरिक्त आपूर्तिकर्ता से कोशिकाओं का परीक्षण किया गया, जो एक समान तरीके से काम दिखाई दिया । इसी तरह, हम hiPSC-सीएमएस के विभिंन बैचों की केवल एक छोटी संख्या का इस्तेमाल किया है कि उंहें जांच करने के लिए सत्यापित करें कि वे प्रारंभिक बैच के समान व्यवहार से चुना गया । एक या दो बैचों को अनुपयुक्त समझा गया क्योंकि उनके syncytia ने यहाँ प्रयुक्त संस्कृति स्थितियों के अंतर्गत खराब स्थिरता या reproducibility की थी. अंयथा, औषध विज्ञान “ठेठ” यौगिकों (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से endothelin, isoproterenol, amlodipine, और ponesimod) के एक सीमित पैनल परीक्षण जब बैचों भर में बहुत समान दिखाई दिया । हम केवल hiPSC-मुख्यमंत्री स्वस्थ दाताओं से व्युत्पंन का इस्तेमाल किया । यह आकलन करने के लिए सार्थक हो सकता है कि hiPSC-मुख्यमंत्री हृदय रोग के साथ रोगियों से व्युत्पंन अलग परिणाम प्रदान करेगा, हालांकि स्वस्थ दाताओं और रोगियों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था जब tyrosine कळेनासे अवरोधकों के cardiotoxicity का मूल्यांकन 12. अंत में, हम आम तौर पर 22 इंतजार-संस्कृति में 28 दिनों के लिए दवा प्रभाव को मापने से पहले: एक ही कोशिकाओं के प्रतिबाधा रिकॉर्डिंग के साथ हमारे अनुभव में, धीमी गति से प्रतिबाधा के लिए एक स्थिर राज्य (कोशिका परत स्थिरता का एक संकेतक) और तेजी से प्रतिबाधा (एक संकेतक की धड़कन आवृत्ति) संस्कृति में 12–15 दिनों के बाद पहुंच जाता है । हालांकि, हम 22 प्रतीक्षा करने का फैसला किया–28 दिन, क्योंकि यह समय है जब कार्डियक चैनल और परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल13स्थिर है । यह जांच नहीं की गई कि क्या तुलनीय परिणाम प्राप्त किए जाएंगे यदि कक्षों का पहले या बाद में उपयोग किया गया था ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर संभावित दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए hiPSC के सहज पिटाई की दर का एक बहुत ही सरल माप का उपयोग करता है । इसके अंय तरीकों से अधिक मुख्य लाभ कर रहे है कि मैं) यह एक उच्च प्रवाह जांच पर्यावरण के लिए उत्तरदाई है, द्वितीय) यह cardiomyocytes की गतिविधि और शारीरिक तापमान पर दवाओं के प्रभाव, और iii) रिकॉर्ड यह आवश्यकता नहीं है निष्पादन के लिए या परिणामों के आकलन के लिए विशेषज्ञता electrophysiological ।
एक मांयता कई मानव उपयोग के लिए अनुमोदित दवाओं के साथ प्रदर्शन का अध्ययन में, हमने दिखाया है कि परख मानव चिकित्सा में इस्तेमाल के रूप में मौजूदा नैदानिक डेटा5द्वारा भविष्यवाणी की दवाओं के प्रति प्रतिक्रिया करता है । क्योंकि यह विधि हृदय ताल पर सभी संभावित प्रभाव समझता है, यह इन विट्रो Proarrhythmic परख (सिपा) पहल14 कि विशेष रूप से प्रो-arrhythmic क्षमता का आकलन में व्यापक पूरक ।
भविष्य में, इस विधि को सहज पिटाई की दर को प्रभावित दिखाया दवाओं की विधा की कार्रवाई की एक और समझ प्रदान कर सकता है । यह संभावना है कि अतिरिक्त यंत्रवत जानकारी सीए यात्रियों (जैसे, उनके आयाम या आकार में) की प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग में मौजूद है । प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग उच्च अधिग्रहण दर (जैसे, 30 हर्ट्ज) पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तो इन मापदंडों की धड़कन दर के अलावा आसानी से निकाले जाते हैं, और यह ज्ञात प्रभाव के साथ इन मापदंडों में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए दिलचस्प हो सकता है चिकित्सकीय इस्तेमाल किया दवाओं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की कोई पावती नहीं है.
FDSS7000 fluorescent plate reader | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
not a catalog item | |
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
installed initially in the device |
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FDSS7000 temperature control | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A10118-09 | |
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
C11653-11 | |
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A8687-62 | |
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
U8524-12 | optional alternative to the Igor Pro software |
Igor Pro data analysis software | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) |
Latest version | |
iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | includes cells, plating and maintenance media |
Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (Cologne, Germany) |
Ax-B-HC02-4M | includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes |
384-well cell culture plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
384-well compound plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) |
R8142 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
F6886 | |
N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
C8031 | |
E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) |
BML-KC158 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15140-122 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15250061 |