JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for anaerob protein rensing, anaerob protein konsentrasjon og påfølgende kinetic karakterisering ved hjelp av en oksygen elektrode system. Metoden er illustrert med enzymet DesB, en dioxygenase enzym som er mer stabilt og aktiv når renset og lagres i en anaerob miljø.

Abstract

Oksygen-sensitive proteiner, inkludert de enzymene som utnytte oksygen som et substrat kan ha redusert stabilitet når renset med tradisjonelle aerobic rensing metoder. Dette manuskriptet illustrerer de tekniske detaljene som er involvert i det anaerob renselsesprosess, inkludert utarbeidelse av buffere og reagenser, metoder for kolonnen Ture i en hanskerommet og avsalte av protein før kinetics. Også beskrevet er metoder for utarbeidelse og bruke en oksygen elektrode for å utføre kinetic karakteristikk av et enzym som oksygen-bruk. Disse metodene er illustrert med dioxygenase enzymet DesB, en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6.

Introduction

Enzymer som bruker jern eller andre metaller aktivere oksygen er ofte utsatt for inaktivering i løpet av en renselsesprosess på grunn av fjerning fra redusere miljøet i en celle. Derfor disse proteinene må brukes som celle lysates, utsettes for eksterne reduksjonsmidler eller rense anaerob for å sikre at de har optimal enzymatisk aktivitet1,2,3,4. For disse enzymene som er oksygen-sensitive (spesielt jern inneholder enzymer), utføre alle rensing og karakterisering trinnene samtidig anaerobe forholdene nødvendig for fullt karakterisere dem. Dette har ledet forskerne å utvikle hele laboratorium set-ups innenfor rammen av anaerob kamre for studier fra protein uttrykk gjennom krystallografi5,6,7,8 .

Her rapporterer vi metoder for det anaerob rensing og kinetisk karakteristikk av enzymet DesB bruker en oksygen elektrode system. DesB er en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6 som er knyttet til LigAB, en protocatecuate dioxygenase fra den samme organismen. Begge enzymer tilhører type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) gruppe som ikke har blitt grundig undersøkt til dato9, sannsynlig delvis på grunn av enzymer i denne overfamilie blir utsatt for inaktivering når renset ved hjelp av standard aerobic protein rensing metoder. Siden noen av de PCAD enzymene vise substrat promiskuitet mens andre er substrat-spesifikke2,10, ytterligere er karakteristikk av denne overfamilie nødvendig å identifisere spesifisitet determinanter. Som har blitt observert i flere enzymet overfamilier11,12,13,14,15, kan små molekyler endre aktivitet via direkte konkurrerende hemming eller binding av molekyler å skille allosteric lommer som forårsaker en økning eller nedgang i enzymatisk aktivitet16. Mens kinetics alene ikke kan skille innbindingssted for en modulator, bestemme omfanget av en aktivitet endrer er viktig for å forstå virkningene. Som sådan, metoder for kinetic karakterisering av innfødte DesB aktivitet og sin aktivitet i nærvær av 4-nitrocatechol (4NC), et stoff som vanligvis brukes til å karakterisere og hemmer dioxygenase enzymer2,17, 18, vises.

DesB er i stand til å bryte ned gallate, en lignin-avledet aromatiske sammensatte, via en extradiol dioxygenase (EDO) reaksjon i som ringen er åpning katalysert bruker oksygen som en av underlag10,19. Denne enzymatiske reaksjonen skjer innenfor rammen av nedbryting av lignin, en aromatisk heteropolymer funnet i cellen vegg av planter. Lignin kan være depolymerized, gir et utvalg av aromatiske forbindelser som kan videre deles inn i sentrale metabolitter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalysere en ring åpne reaksjon på dihydroxylated aromatiske forbindelser, der cleavage oppstår ved siden av et metall koordinerte diol; derimot cleave intradiol dioxygenases analoge aromatiske forbindelser mellom de to hydroksyl gruppene (figur 1). EDOs, som mange andre metalloenzymes, har en divalent metall senter for koordinerende Fe(II) består av en to-histidin, ett-carboxylate triaden9,34,35. Disse metalloenzymes blir oksidert, via autoxidation eller mekanisme-baserte inaktivering, mens enzymet gjengis inaktive2,36,37,38.

I eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i dette manuskriptet, benytter vi DesB, medlem av PCAD gruppe fra bakterien Sphingobium sp. forhold-6, å katalysere tillegg av oksygen over C4-C5 bånd gallate (figur 2A). Regiochemistry denne cleavage er analoge til LigAB, som er en protocatechuate-4,5-dioxygenase (figur 2B). Så langt, inkluderer undersøkelser av denne gallate dioxygenase noen rapporter om forbindelser som hemmer DesB10,19,39. Med bruk av aerobic rensing metoder utstilt DesB variabel aktivitet, mens med bruk av anaerob metoder kunne vi konsekvent få protein reproduserbar aktivitet. Kinetisk erfaringene beskrevet her viser metodene for anaerob rensing av DesB, kinetisk karakterisering av reaksjonen av DesB med gallate, og hemming av DesB av 4-nitrocatechol (4NC).

Protocol

1. generelle materiale og metoder Forberede alle nødvendige medier som beskrevet i tabell 1. Autoclave på 120 grader i 15 min. Sterile filtrere det SOC løsningen, etter MgCl2 og glukose, ved å sende det gjennom en 0,2 µm. Justere pH i Miller’s Lysogeny kjøttkraft (LB media) løsning før autoklavering. Tillegg LB-Amp media løsning etter autoklavering sterilt løsninger på 0.2 mM L-cystein, deretter 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate å forbedre protein uttrykk og oppløselig…

Representative Results

Vist er SDS side gel analyse av individuelle fraksjoner rensing av DesB-maltose bindende protein (MBP) fusion Konstruer (Figur 3). Gel avslører at protein er ren (MW = 91.22 kDa), bortsett fra tilstedeværelsen av DesB (MW = 49.22 kDa) og MBP protein domene (42 kDa) kløyvde fra hverandre. Brøker E2 og E3 ble valgt for konsentrasjon (trinn 4.2). Reproduserbar resultater fra DesB kinetic analyser, …

Discussion

De avgjørende skritt i å få aktiv, renset DesB protein innebære forming og opprettholde det reduserte Fe(II) aktive området i enzymet. Rett slik ytelse av induksjon, renselse, konsentrasjon, og avsalting tiltak er avgjørende for å kunne oppnå aktiv enzym. Inducing protein uttrykk i nærvær av 1 mM jernholdige ammonium sulfate sikrer at Fe(II) er riktig innlemmet i det aktive området av DesB. Denne metoden er inspirert av studier som de med amidohydrolase metalloenzymes, som ofte krever tillegg av metall til vek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Dr. Camille Keller Wesleyan University kundestøtte. Spesiell takk til Professor Lindsay D. Eltis og Jenna K. Capyk fra University of British Columbia, samt Christian Whitman fra University of Texas i Austin, for deres råd om anaerob protein rensing metoder og bruk av en O2 -sensitive elektroden.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. 생화학. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. 생화학. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. 생화학. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. 생화학. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. 생화학. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

Tags

AnaerobicProtein PurificationKinetic AnalysisOxygen ElectrodeDesB DioxygenaseEnzyme ActivityInhibitionInorganic BiochemistryOxygen-sensitive MetalsProtein ExpressionCell PelletAmylose ColumnLysozymeHigh-pressure HomogenizationNitrogen GasGlove BoxAmylose Column BufferElution BufferFerrous Ammonium SulfateDithiothreitol
check_url/kr/58307?article_type=t&slug=anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image