Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. Huidige synthetische hydrogels bieden robuuste mechanische ondersteuning voor in vitro cultuur van de cel, maar gebrek aan de nodige eiwitten en ligand samenstelling om te ontlokken fysiologische gedrag uit cellen. Dit manuscript wordt een fabricage methode voor een nier cortex ECM-afgeleide hydrogel beschreven met goede mechanische robuustheid en ondersteunende biochemische samenstelling. De hydrogel is vervaardigd door mechanisch homogenisatie en solubilizing decellularized menselijke nieren cortex ECM. De matrix behoudt inheemse nier cortex ECM eiwit ratio’s, maar ook het inschakelen van gelering aan fysiologische mechanische stiffnesses. De hydrogel fungeert als een substraat op welke nier cortex-afgeleide cellen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gehandhaafd. Bovendien kan de hydrogel samenstelling worden gemanipuleerd om het model van een zieke omgeving waarmee de toekomstige studie van nierziekten.
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. De complexe moleculaire samenstelling regelt zowel structurele en functionele eigenschappen van weefsel. Structurele proteïnen cellen voorzien van ruimtelijke bewustzijn en zorgen voor de hechting en migratie1. Afhankelijke liganden interactie met cel oppervlakte receptoren waarmee cel gedrag2. Nier ECM bevat een overvloed aan moleculen waarvan de samenstelling en structuur hangt af van de anatomische locatie, ontwikkelingsstadium en ziekte staat3,4. De complexiteit van ECM Recapitulerend is een belangrijk aspect bij het bestuderen van de nier-afgeleide cellen in vitro.
Eerdere pogingen om het repliceren van de ECM microenvironments hebben gericht op decellularizing hele weefsel maken steigers staat recellularization. Decellularization is uitgevoerd met chemische schoonmaakmiddelen zoals natrium dodecyl sulfaat (SDS) of niet-ionogene schoonmaakmiddelen, en het maakt gebruik van beide hele orgel perfusie of onderdompeling en agitatie methoden5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De steigers die hier gepresenteerd behouden de signalen van het structurele en biochemische gevonden in native weefsel ECM; Bovendien, recellularization met donor-specifieke cellen heeft klinische relevantie van reconstructieve chirurgie14,15,16,17,18, 19. echter deze steigers ontbreken van structurele flexibiliteit en zijn daarom niet compatibel met vele huidige apparaten die worden gebruikt voor in vitro studies. Om deze beperking te overwinnen, hebben vele groepen decellularized ECM verder verwerkt tot hydrogels20,21,22,23,24. Deze hydrogels zijn compatibel met spuitgieten en bioink en micrometer schaal ruimtelijke beperkingen die decellularized steigers plaats op cellen te omzeilen. Bovendien zijn moleculaire samenstelling en ratio’s gevonden in native ECM3,25bewaard. Hier tonen we een methode om een hydrogel afgeleid van nier cortex ECM (kECM).
Het doel van dit protocol is voor de productie van een hydrogel die de communicatie van de corticale nier-regio repliceert. Cortex nierweefsel is decellularized in een oplossing van de SDS 1% onder constante agitatie verwijderen van cellulaire zaak. SDS wordt vaak gebruikt voor decellularize weefsel vanwege de mogelijkheid om snel te verwijderen immunologische cellulaire materiële6,7,9,26. De kECM is vervolgens onderworpen aan mechanische homogenisering en lyofilisatie5,6,9,11,26. Solubilisatie in een sterk zuur met pepsine resulteert in een definitieve hydrogel stockoplossing20,27. Inheemse kECM eiwitten die belangrijk voor structurele zijn steun en signaal transductie3,25worden bewaard. De hydrogel kan ook worden gegeleerde naar binnen één orde van grootte van inheemse menselijke nieren cortex28,29,30. Deze matrix biedt een fysiologische omgeving die is gebruikt om de onbeweeglijkheid van nier-specifieke cellen in vergelijking met hydrogels van andere matrix-proteïnen. Bovendien, matrix samenstelling kan worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld door de toevoeging van collageen-I model ziekte omgevingen voor de studie van de renale fibrose en andere nier ziekten31,32.
Matrices bieden belangrijke mechanische en chemische signalen die cel gedrag. Synthetische hydrogels kunnen ondersteunen complexe 3-dimensionale patronen, maar niet aan de uiteenlopende extracellulaire aanwijzingen gevonden in fysiologische matrix microenvironments geven. Hydrogels afgeleid van inheemse ECM zijn ideale materialen voor zowel in vivo en in vitro studies. Eerdere studies hebben gebruikt decellularized ECM hydrogels jas synthetische biomaterialen om te voorkomen dat de host immunologische r…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen de Lynn en Mike Garvey Imaging laboratorium op het Instituut voor regeneratieve geneeskunde, stamcel en LifeCenter NorthWest. Zij wil ook de financiële steun van de National Institutes of Health subsidies, UH2/UH3 TR000504 (naar J.H.) en DP2DK102258 (voor Y.Z.), NIH T32 opleiding subsidie DK0007467 (R.J.N.) en een onbeperkte geschenk van de Northwest nier centra aan de Nier onderzoek instituut.
Preparation of Kidney Tissue | |||
5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
Fabrication of ECM Gel | |||
Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
Kidney ECM Gelation | |||
1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |