Den noden och notochordal plattan är övergående signalering arrangörer i utveckla musembryon som kan visualiseras med hjälp av flera tekniker. Här beskriver vi i detalj hur du utför två av teknikerna för att studera deras struktur och morfogenes: 1) svepelektronmikroskopi (SEM); och 2) hela mount immunofluorescens (WMIF).
Efter implantation mus embryot genomgår stora formförändringar efter inledningen av gastrulation och morfogenes. Ett signum för morfogenes är bildandet av övergående arrangörerna, den noden och notochordal plattan, från celler som har passerat genom den primitiva drag. Ordentlig bildandet av dessa signalering centra är viktigt för utvecklingen av kroppen planen och tekniker att visualisera dem är av stort intresse för mus utvecklingsmässiga biologer. Den noden och notochordal plattan ligga på den ventrala yta gastrulating musembryon runt embryonala dag (E) 7,5 utveckling. Noden är en skålformade struktur vars celler besitter en enda smal cilie varje. Den ordentlig subcellulär lokalisering och rotation av flimmerhåren i noden gropen bestämmer vänster höger asymmetri. Notochordal platta celler besitter också enda cilier om än kortare än de av nod cellerna. Notochordal plattan bildar den ryggsträng som fungerar som en viktig signalering arrangör för somitogenesis och neurala mönster. Eftersom cellerna i den noden och notochordal plattan är övergående närvarande på ytan och besitter cilier, kan de visualiseras med hjälp av scanning electron microscopy (SEM). Bland andra tekniker som används för att visualisera dessa strukturer på cellnivå är hela berget immunofluorescens (WMIF) med hjälp av antikroppar mot de proteiner som uttrycks mycket i nod och notochordal tallrik. I den här rapporten beskriver vi vår optimerade protokoll för att utföra SEM och WMIF på den noden och notochordal plåt i framkallande musembryon till hjälp i bedömningen av vävnad form och cellulära organisation i vildtyp och gastrulation mutant embryon.
Gastrulation och medföljande morphogenetic rörelser är avgörande för att forma mus embryo1. Förändringar i cellulära form och organisation under morfogenes diktera positionell information för att reglera cellen öde och även tillåta de efterföljande signalvägar just utföra sina funktioner för att diversifiera den nybildade groddar lager1. Bildandet av övergående organisera strukturer och signalering centra som nod och ryggsträng är nödvändigt för utförandet av den utvecklande program2. Utvecklingsmässiga biologer har använt en mängd olika tekniker för att studera morfogenes av dessa strukturer, mest anmärkningsvärda är användningen av cellulära reportrar och levande ex vivo imaging för att följa dynamiken i cellulär och subcellulär beteende2 ,3,4. I detta betänkande, vi fokuserar på att beskriva detaljerna i våra optimerade protokoll för två av dessa tekniker: scanning electron microscopy (SEM) och hela berget immunofluorescens (WMIF), som var och är fortfarande avgörande för studera morfogenes av noden och notochordal plattan, föregångaren till ryggsträng.
Noden mus embryonala är en droppformad kopp av celler som ligger på ventrala ytan av mus embryot runt början till sena huvud fold stadier under gastrulation och morfogenes (embryonala dag, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal plattan utgår morfologiskt anteriorly från nod3. Varje cell i nod och notochordal plattan karakteriseras av en enda cilie som sticker ut på utsidan, som är längre i noden celler men vars längd varierar med utvecklingsstadier2. Rotation av cilier i noden gropen har visat sig vara viktigt för signalering som avgör vänster höger asymmetri4. Notochordal plattan är föregångaren till ryggsträng, signalering centrum som är viktig för mönstringen av de intilliggande thoraxsegmenten och överliggande neuralrörsdefekter3.
På grund av attributen för läge (yta), form (cup) och som har tydliga yttre cellulära strukturer (cilier), har SEM traditionellt använts för att visualisera nod och notochordal plattan och studera deras bildning och struktur2, 7. SEM används också för att studera förändringarna i strukturen av noden själv eller flimmerhår på dess celler i mutationer som påverkar gastrulation, morfogenes, samt flimmerhår bildas8,9,10. SEM är en teknik som använder en fokuserade strålen av elektroner att förhöra den topologiska ultrastruktur av den yttre ytan av material såsom biologiska prover11. Provet är oftast fast, torkas och sedan fräsande-belagda med metaller för observation under ett svepelektronmikroskop som vi beskriver i steg 1.
WMIF är en färgning teknik för att visualisera genprodukter, såsom proteiner, i tre dimensioner (3D). WMIF av vävnader, organ eller ens hela organismer ger rumslig information om fördelningen av signalen och formen på den resulterande strukturen i 3D. Tekniken bygger på att åtgärda provet sedan färgning det med fluorescerande konjugat. Mus embryon ~ E7.5 är små och transparent och därför idealisk för WMIF protokoll att visualisera den noden och notochordal tallrik. Till exempel den transkriptionsfaktor som Barchyury (T) uttrycks i kärnor av nod och notochordal tallrik, och i mindre utsträckning i de primitiva strimma, runt E7.5-E8 av embryonal utveckling och bra fungerande antikroppar mot T av WMIF är kommersiellt tillgängliga och göra färgningsproceduren möjligt. Cellerna på den noden och notochordal tallrik kännetecknas också av förträngda apical ytbehandlar, som möta på utsidan och därmed kan färgas med fluorescens-konjugerad Phalloidin till varumärket F-aktin de apikala sammandragningar. Med dessa reagenser som exempel, ger en kombination av T och F-aktin färgning av WMIF en representation av den noden och notochordal pläterar i 3D i gastrulating musembryon som vi visar i steg 2 8. Markörer av cilier, såsom ARL13B eller acetylerade tubulin, samt andra markörer för den nod och notochordal tallrik, såsom FOXA2, kan dock också användas för att utföra WMIF på utveckla mus embryon3,4.
Vi har visat att striatin-interagera protein 1 (STRIP1) är viktigt för normal gastrulation och morfogenes i mus embryot8. STRIP1 är en kärnkomponent i den striatin-interagera fosfataser och kinaser komplex (STRIPAK), som vi och andra har inblandade i aktin cytoskelettet organisation8,12. En större defekt i Strip1 mutant embryon är i bildandet av axial mesoderm (nod och notochordal tallrik) och förlängning av ryggsköldens kropp axeln. Vi har använt SEM och WMIF för att analysera den noden och notochordal tallrik med vildtyp (WT) och Strip1 mutant embryon som vi visar i Representativa resultat och motsvarande siffror.
I detta arbete visar vi hur du utföra SEM och WMIF för att visualisera mus embryonala nod och notochordal tallrik. Den lilla storleken på gastrulating musembryon ~ E7.5 och förekomsten av dessa strukturer på ytan gör dem idealiska att studera med hjälp av tekniker beskrivs2,7,8. Tillgången på bra antikroppar, såsom T och flimmerhåren markörer, ger utmärkt 3D-information med hjälp av WMIF på struktur, organisation och bildandet av dessa väsentliga embryonala arrangörerna8.
Eftersom musen embryonal utveckling fortsätter i mycket snabb takt och den noden och notochordal plattan är endast övergående finns på ytan av embryot, är timing viktigt för att lyckas med dessa experiment2,3. Exempelvis är 2-4 somite embryon bra för SEM-analys av en mogen nod grop med långa cilier. I mycket tidigare eller senare embryon (exempelvis 12 h före eller efter), kan noden inte vara närvarande på ytan. WMIF är lite mer flexibla i detta avseende men strukturer själva är också övergående under utveckling och tidpunkten i detta fall beror på forskarnas intressen.
Renhet av reagenser är också viktigt för att lyckas med dessa tekniker, särskilt i sondera ultrastruktur av SEM. Tiny föroreningar som fastnar embryona oftast resultera i enorma artefakter.
Vi har testat två olika metoder för embryo fixering för SEM ett med halv Karnovskys fixativ (2,5% glutaraldehyd, 2% PARAFORMALDEHYD och 0,1 M cacodylate buffert) och en enklare 2,5% glutaraldehyd i 1 x PBS. Vi föredrar att använda glutaraldehyd och PBS fixativ som beskrivs i steg 1, men vi och andra har också använt den halva Karnovskys fixativ framgångsrikt för SEM.
Vi har också jämfört två metoder för torkning embryon för SEM och fann ingen skillnad i kvaliteten på provet med hjälp av en kritisk punkt torktumlare eller HMDS som beskrivs i steg 1 och redovisas på annat håll14.
För steg 2, vi testade inbäddning embryon efter sista tvätt stegen i 1% agaros som låg smälttemperatur monterad på en 35 mm glasbotten maträtt och sedan toppade det med ~ 10 µL monteringsmedium. Denna inbäddning metod fungerar och bevarar den ursprungliga 3D-strukturen för embryot och associerade strukturer. multiphoton Mikroskop krävs dock att bilden preparatet eftersom regelbundna confocal Mikroskop inte kan nå så djupt in i de intakta embryona (~ 1 mm).
Vi tror att använda dessa två tekniker ger kompletterande information om strukturen på noden och notochordal plattan under normala utveckling och mutanter som visar defekter i bildandet av dessa strukturer.
The authors have nothing to disclose.
H.B. stöds av start finansiering från den medicinska fakulteten och SFB829 av universitetar av Cologne. C.X. stöds av DFG bevilja BA 5810/1-1. Vi vill tacka Imaging faciliteterna på CECAD research center och Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Vi tackar Joaquín Grego-Bessa (spanska National Center för kardiovaskulär forskning, Madrid, Spanien) för hans insikt om montering embryon för WMIF.
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |