여기 우리는 초파리 S2R + 셀을 사용 하 여 수축 분석 결과 설명 합니다. Exogenous ligand, 접힌된 gastrulation (안개)의 응용 프로그램 신호 통로 세포 수축 안개의 활성화에 지도 한다. 이 분석 결과 세포 수축 단백질 안개 신호 전달 경로에서 규제 조사를 사용할 수 있습니다.
우리는 세포 기반 분석 결과 초파리 세포를 사용 하 여 접힌된 gastrulation (안개), secreted 상피 morphogen 시작 꼭대기 긴축이 개발 했습니다. 이 분석 결과에서 안개로 G 단백질 결합 된 수용 체 (안개), Gα12/13 단백질 (콘 서 티 나/Cta), 및 PDZ 도메인-포함 된 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (RhoGEF2)를 포함 하는 신호 폭포를 통해 활성화는 주 작동 근으로 사용 됩니다. 안개 신호 수축 지갑 문자열을 말라 골격의 급속 하 고 극적인 개편에서 결과. 수용 성 안개 안정적인 셀 라인에서 수집 하 고 ectopically 셀에 적용 된 S2R +, gastrulation 같은 발달 과정 동안 프로세스 관찰 꼭대기 수축 같은 형태학 상 변화를 선도. 이 분석 결과 높은 처리량 검열 의무가 있으며, RNAi를 사용 하 여이 통로에 관련 된 추가 유전자의 식별을 용이 하 게 수 있습니다.
유전 모형 유기 체와 함께 실시 하는 embryogenesis의 연구는 세포 조직으로 조립 되는 방법에 대 한 우리의 이해에 귀중 한 입증 했다. 초파리 melanogaster의 연구 특히 이끈 핵심 유전자와는 morphogenesis 직접 생물학 원리의 식별 및 생물의 개발에 성인1,2 수정에서 , 3. 실시 초파리유전자 연구에 병렬로 과일 파리 조직에서 파생 된 교양된 셀 라인 또한 분자의 넓은 범위를 해결 하기 위해 강력한 시스템으로 등장 했습니다 및 세포 생물학 질문4, 5 , 6. 그들은 실내 온도 CO2없이 교양 초파리 조직 배양 세포 유지 관리에 대 한 최소한의 요구 사항을. 이와 같이, 그들은 의무가 고해상도 이미징, 그리고 그들은 유전자 억제에 자화 율의 높은 학위 RNAi6,7. 많은 그룹 사용 초파리 조직 배양 세포 도구로 셀 모양, cytoskeletal 역학, 생존, 식 균 작용, 및 신호 변환 통로4,8, 정의에 관련 된 유전자를 발견 하 9,,1011. 전체 동물 함께 모델 고용, 교양된 초파리 셀 라인의 제공 분자는 개발에 대 한 중요 한 식별을 가속화 하 고 있는 프레임 워크를 제공 하는 매우 상호 보완적 접근 12그들의 기계적 역할 결정 합니다. 여기, 우리는 꼭대기 긴축 통해 접혀 gastrulation (안개) 통로13,14트리거 신호 경로 연구 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 수축 세포 기반 분석 결과 모두 안개 신호 통로 비 근육 myosin II 수축 조절 하는 분자 메커니즘을 조사 하는 연구를 수 있습니다.
초기 초파리 배아의 gastrulation는 상피 morphogenesis 및 세포 전환 상피 간 엽 세포 id에 대 한 유전 모형으로 몇 년 동안 공부 했다. Gastrulation의 주요 이벤트 중 morphogenesis 모양15,,1617,18에 피라미드를 원주에서 배아 복 부 정중 선 따라 상피 세포의 부분 집합의 이다. 이 간단한 셀 모양 추정 mesodermal 세포의 국제화에 결과 변경 하 고 비 근육 myosin II 말라 네트워크16,,1920constricting의 모터 활동에 의해 구동 됩니다. 유전자 연구의 십 년간이이 통로의 분자 구성 요소를 확인 했다 하 고 다음 순서에 따라 순차적으로 그들을 배치 했다: 1) 안개 복 부 정중 선;에서 상피 세포의 꼭대기 도메인에서 분 비 2) 안개 G 단백질 결합 하는 공동 수용 체, 안개 및 스모그에 바인딩하고 복잡 한 Gα12/13 소 단위는 정식이 아닌 GEF 릭-8;에 의해 chaperoned는 콘 서 티 나 (Cta)를 포함 하는 heterotrimeric G-단백질을 통해 신호 3) Cta 활성화 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인, RhoGEF2, 차례 차례로 활성화 하는 작은 G-단백질 Rho1; 4) Rho1 활성화로 니 (한국); 5) 한국 활성화 비 근육 myosin II 수축 규제 빛 체인 (RLC)의 인 산화를 통해 꼭대기 도메인에 따라서 생산 꼭대기 수축 (그림 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,,2829. 이러한 구성 요소 중 몇 가지에 변이 정상 gastrulation와 날개 디스크 및 침 샘,이 통로 초파리 의 여러 단계에서 사용 해야 함을 나타내는의 형성을 포함 하 여 다른 전체적 움직임 방해 embryogenesis30,,3132. 안개 통로 상피 형성을 위한 최고의 공부 모델 중 하나 이며 중요 한 통찰력을 어떻게 조직 수준 morphogenesis 골격 구동 셀 움직임14,15 유전자 전사에서 통제 된다 제공 했다 ,21.
우리는 많은 세포질 응답의 하류 안개의 비행 배아17개발에 관찰이 수축 세포 기반 분석 결과 개발. 우리는 안개를 표현 하는 세포 라인에의 C- myc 매체에 황산 구리 (CuSO4)의 추가 따라 수확 수 있는 유도할 수 있는 metallothionine 발기인의 통제와 태그 안정 S2 설계. 셀의 개편을 받아야 안개 조건 미디어 S2 수용 체 + (S2R +) 세포, Frizzled 및 integrin 소 단위와 같은 수용 체의 그들의 차동 식에 의해 구별 s 2 세포의 subline, ectopically 적용 되는 골격 높은 꼭대기 수축12,17,,2733의 연상. 이러한 변화는 안개에 치료 비 근육 myosin II 수축에 방사형 증가 나타내는 단계 어두운 주름의 모양을 리드 단계 대조 현미경 검사 법 또는 형광 현미경 검사 법 안개 치료에 이르게 하 여 관찰 될 수 있다는 비 근육 myosin II 고리 EGFP 태그 RLC34를 표현 하는 셀의 형성. 이 고리는 myosin phosphorylated 규제 빛 체인 (pRLC) 표시 를 통해 immunostaining23,,3435포함. 이 안개 유도 응답 필요한 Cta, RhoGEF2로, 및 한국; 따라서, 재조합 안개-Myc 및 S2R + 셀을 사용 하 여, 우리 조직 문화 기반 시스템24,,2534에 안개 유도 수축 조사 하 설립 했다.
여기, 선물이 초파리 조직 문화 전지 라인 (S2R + 셀), 겪 습 비 근육 myosin II 수축 안개에 대 한 응답으로이 사용 하 여 수축 세포 기반 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 신호. 이 분석 결과 안개 통로, 뿐만 아니라 비 근육 myosin II 수축 조절 메커니즘을 조사 하 고 유용 합니다.
세포 배양 고려 사항:
아래는 S2R + 셀 유지 조건이 분석이 결과에서 신뢰할 수 있는 데이터를 달성 하기 위해 매우 중요 하다. 방패와 상 M3 곤충 매체에 S2R + 세포를 유지 하기 위해 최고의 수축 분석 결과, 수행 계획. S2R + 셀 수 있는 다른 곤충 세포 배양에서 번 창 하는 동안 (예를 들어, SF900 또는 슈나이더의 곤충 매체), 그들은 종종 안개에 그들의 응답을 잃게됩니다. S2R + 세포 높은 통행 수, 더 이상 일반적으로 20-25 구절, RNAi에 감도 잃고 시작 합니다. 그것은 모든 실험에 대 한 초기 통과 셀을 사용 하입니다. RNAi 고갈 실험에 또 다른 중요 한 측면은 적절 한 컨트롤을 선택 하 고. 일반적인 부정적인 컨트롤 포함 dsRNA 타겟팅 EGFP 또는 pBlueScript, 어느 쪽도 아니는의 비행 게놈에 상 동. 안개 통로 (로, 한국, 등)에서 단백질을 대상으로, 어떤, 고갈 때 아닌 근육 myosin 수축 활성화 되지 않도록, 또한 유용한 컨트롤. S2:Fog-Myc 셀 페니실린, 100 µ g/mL 스의 100 단위/mL으로 보충 하는 SF900와 같은 다른 세포 배양 매체에 유지 될 수와 0.25 암포 B. 참고는 FBS는 때 SF900에서 세포를 배양 하지 필요. 셀 밀도 초파리 조직 배양 세포의 모든 측면에 중요 한 구성 요소 이기도합니다. 포유류 직물 문화 세포, 초파리와 달리-파생된 조직 문화 세포 높은 세포 밀도에서 최고 번성 (밀도 5 x 105 셀/mL 보다 더 낮은). 그러나,이 분석 결과 수행 하는 경우 그것은 중요 한 세포는 80% 합류, 위에 유리 바닥 요리 콘 A 코팅 도금 하지 계약 대 비 계약 셀의 정량화는 매우 지루한 될 것 이다.
중요 한 측면과 세포 수축 분석 결과의 다른 방법:
안개, 비 근육 myosin II 수축은 ligand의 생산은이 분석 결과의 주요 구성 요소 이다. 안개 유전자 ~ 78 kDa26의 예측 분자 무게 730 아미노산의 단백질을 인코딩합니다. Hydropathy 분석에 안개의 아미노산-분 비 신호 순서로 작동할 수 있는 12 소수 성 잔류물의 뻗 기를 계시 했다. 또한, 코딩 시퀀스 추가 제안 하는 안개는26분 비 단백질 잠재적인 N-및 O-연결 된 glycosylation 여러 사이트를 포함 되어 있습니다. 이 지원 안개 꼭대기 수축16을 겪고 추정 표 피 세포에서 분 비 소포에 지역화 되었습니다. 안개-Myc 식 매체, 구리 황산의 추가 따라 유도 되었다 안개 또는 Myc에 대하여 항 체 문화 매체에서 150-kD 단백질 유도 문화에서 수확 그러나에서 아닙니다 유도 안개 Myc 구문 부족 S2 세포에서 미디어를 인식 하 고 있습니다. 이 분자량의 예측된 80-kD 분자량 보다 높았다 고 S2 세포의 분 비 기계 glycosylate exocytosis 전에 단백질을 수 있습니다 제안 합니다. 안개 정화에 잠재적인 가변성 때문 그것은 모든 실험에 대 한 안개 조건 미디어의 동일한 일괄 처리를 사용 하는 것이 좋습니다. 집중된 안개-Myc 미디어의 큰 일괄 처리를 만드는 실험의 라운드에 걸쳐 일관성을 유지 하는 데 도움이 됩니다.
이 분석 결과의 성공 또한 자신 있게 수축 받은 셀 식별에 따라 달라 집니다. 죄이 고 세포는 말라 또는 비 근육 myosin II, 얼룩에 의해 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 될 수 있다 하는 동안 식별 하 고 압축된 셀 계량 가장 신뢰할 수 있는 방법은 단계 대조 또는 DIC 현미경입니다. 대부분의 표준 가벼운 현미경에 20 X-40 X 확대를 사용 하 여 정확한 수를 얻을 수 있습니다. 프로토콜 작성 여기 유리 바닥 접시를 사용 하지만 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 표준 1.5 유리 coverslips 콘 a 코팅을 사용 하 여 안개 또한 35mm 안개 각 분석 결과 대 한 사용의 양을 제한 하려면 parafilm에 배치 하는 coverslip에 조직 문화에에서 할 수 있습니다. 제대로 고정된 셀 수 가양성으로 고정 품질 분석 결과의 중요 한 구성 요소입니다. 신선한 고정 솔루션을 사용 하 고 있는지 결코 건조 한 번 고정 셀 더 신뢰할 수 있는 결과 이어질 것입니다. 마지막으로, 그것은 세포의 많은 수를 계산 하는 것이 중요입니다. 일반적으로, 단지 30%-50%의 치료 또는 제어 RNAi 대우 셀의 관류 다음 수축. 그러나, 셀의 많은 죄이 고 셀의 분수에 어떤 변화 든 지 치료 때문 인지 필요 하다 그래서 S2R + 세포에서 발생 하는 수축의 기초 수준이입니다. 또한, 비 근육 myosin II 수축의 규칙에 관련 된 몇 가지 단백질의 고갈 하이퍼-수축, 안개의 부재에도 발생할 수 있습니다. 여기에 제시 된 데이터는 3 연속 RNAi 치료 안개 조건 미디어의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 계산 된 3600 셀에서 이다.
세포질 수축 분석 결과의 응용 프로그램:
이 수축 분석 결과, 심사 방법, RNAi와 결합 하면 세포 신호, morphogenesis, 및 세포 수축에 강력한 시스템을 제공 합니다. 이전에, 그것 두 안개 공동 수용 체21중을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 138 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 대상된 화면 S2R + 세포, RNAi에 의해 고갈 되 고 여기에 제시 된 프로토콜에 설명 된 대로 안개에 대응 하는 능력 분석 했다. 138 GPCRs, 단일의 이전 새롭거나 유전자, 지금은 안개로 알려진 덮여 되지 않았습니다. 미스 트의 기능으로 추가 조사 시연 S2R + 셀, 안개 유도 세포 수축에 필요한 했다 뿐만 아니라 그것은 또한 gastrulation 초파리21개발에 대 한 필수. 또한,이 분석 결과 그 릭-8, 비 정식 GEF는 또한 안개 신호 통로27설명 하기 위해 사용 되었다. 일련의 수축 분석 결과 함께 결합 epistasis RNAi 실험 시연 릭-8 Gα12/13 소 단위 Cta와 안개 유도 세포 수축31에 중요 한 셀 내에서 지역화 기능 작용 .
초파리 조직 배양은 셀 쉽게 실내 온도 유지, CO2 필요 하지 않습니다 또는 세포 배양 매체, 버퍼링 하 고 강력한으로 적절 한 셀 문화 밀도 유지 됩니다, 초보자에 게 적합 합니다. 세포질 수축 분석 결과 학생 자란 세포 또는 현미경 작은 아무 경험을 했다 대학 세포 생물학 과정의 실험실 섹션에서 성공적으로 수행 되었다. 여기에 제시 된 세포 수축 분석 결과 유전자 검색에 사용할 수 있는 강력한, 셀 기반 도구를 나타냅니다 또는가 안개 신호 전달 경로, 더 나은 우리를 돕고 꼭대기 수축 등의 개발 프로세스를 이해 하 고 일반 비 근육 myosin II 수축.
The authors have nothing to disclose.
저자는 로저스 실험실 및 Applewhite 실험실, 그 레 타 글 로버, 그리고이 프로토콜의 개발에 기여한 리드 대학 봄 2018 세포 생물학 과정에 학생 들의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자는 신중 하 게 읽기 및 편집이 원고에 대 한 리츠 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 716964 D.A.A.와 아칸소 리드 대학 생물학과 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다.
S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, undergoes apical constriciton |
S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |