Här beskriver vi en kontraktilitet analysen använder Drosophila S2R + celler. Tillämpningen av en exogen ligand, vikta gastrulation (dimma), leder till aktivering av dimman signalering utbildningsavsnitt och cellulära kontraktilitet. Denna analys kan användas för att undersöka reglering av cellulära kontraktilitet proteiner i dimman signalering utbildningsavsnitt.
Vi har utvecklat en cell-baserad analys använder Drosophila celler som recapitulates apikala sammandragning initierats av vikta gastrulation (dimma), en utsöndrade epitelial morphogen. I denna analys används Fog som en agonist för att aktivera Rho genom en signalering kaskad som inkluderar en G-protein-kopplade receptor (dimma), ett Gα12/13 protein (Concertina/Cta), och en PDZ-domän-innehållande guanin nukleotid exchange faktor (RhoGEF2). Dimma signalering resulterar i snabba och dramatiska omorganiseringen av aktin cytoskelettet att bilda en kontraktila handväska sträng. Lösliga dimma samlas in från en stabil cellinje och tillämpas ectopically på S2R + celler, vilket leder till morfologiska förändringar som apikala sammandragning, en process som observerats under utvecklingsprocesser såsom gastrulation. Denna analys är mottagliga för high-throughput screening och, med hjälp av RNAi, kan underlätta identifiering av ytterligare gener involverade i denna väg.
Studier av embryogenes utförts med genetiska modellorganismer har visat sig vara ovärderligt för vår förståelse av hur celler är monterade i vävnader. Studier av Drosophila melanogaster, i synnerhet, har lett till identifiering av viktiga gener och biologiska principer som styr morfogenes och utveckling av organismer från befruktning till vuxenlivet1,2 , 3. parallellt med den genetiska forskningen med Drosophila, odlade cellinjer som härstammar från bananflugan vävnader har också framkommit som ett kraftfullt system att hantera ett brett utbud av molekylära och cell biologiska frågor4, 5 , 6. drosophila vävnadsodling celler har minimala krav på underhåll, eftersom de är odlade i rumstemperatur och utan CO2. Som sådan, de är mottagliga för högupplösta imaging, och de har en hög grad av känslighet för genen hämning av RNAi6,7. Många grupper har använt Drosophila vävnadsodling celler som ett verktyg för att upptäcka gener involverade i att definiera cell form, cytoskeletal dynamics, livskraft, fagocytos och signaltransduktion vägar4,8, 9,10,11. När anställd som modell tillsammans med hela djuret, erbjuder odlade Drosophila cell lines en uppsättning mycket kompletterande metoder att påskynda identifieringen av molekyler som är viktiga för att utveckla och tillhandahålla en ram för att Bestäm deras mekanistiska roller12. Här beskriver vi en cell-baserad analys för att studera de signalvägar som utlöser apikala sammandragning via den vikta-gastrulation (dimma) väg13,14. Denna cell-baserad kontraktilitet analys tillåter forskare att undersöka båda dimman signalering utbildningsavsnitt och de molekylära mekanismer som reglerar icke-muskel myosin II kontraktilitet.
Gastrulation tidiga Drosophila embryot har studerats under många år som en genetisk modell för den epiteliala morfogenes och cellulära övergången från epitelial till mesenkymala cellidentiteten. En av de viktigaste händelserna av gastrulation är morfogenes av en delmängd av epitelceller längs embryonala ventrala mittlinjen från columnar till pyramidal form15,16,17,18. Denna enkla cell formen ändra resultatet i internalisering av de presumtiva mesodermala cellerna och drivs av den motoriska aktiviteten av icke-muskel myosin II bromsande aktin nätverk16,19,20. Årtionden av genetisk forskning har identifierat molekylära komponenterna i denna väg och sekventiellt har placerat dem i följande ordning: 1) dimma utsöndras från domänen apikala av epitelceller vid ventrala mittlinjen; (2) dimma binder till G-protein-kopplade samtidig receptorer, dimma och Smog, och signaler via en heterotrimeric G-protein komplex som innehåller den Gα12/13 subuniten Concertina (Cta), som är chaperoned av den icke-kanoniska GEF Ric-8; (3) Cta aktiverar en guanin nukleotid exchange faktor, RhoGEF2, som i sin tur aktiverar de små G-protein-Rho1; (4) Rho1 aktiverar Rho kinase (Rok); (5) Rok aktiverar icke-muskel myosin II kontraktilitet på den apikala domänen genom fosforylering av den reglerande ljusslinga (RLC), sålunda producerande apikala sammandragning (figur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationer i flera av dessa komponenter störa den normala gastrulation och andra morphogenetic rörelser, däribland bildandet av wing skivan och saliv-körtlar, som visar att denna väg används i flera skeden av Drosophila embryogenes30,31,32. Dimma smittvägen är en av de bäst studerade modellerna för epitelial forma och har gett viktiga insikter i hur vävnad-nivå morfogenes regleras från gentranskription till cytoskelettet-driven cell rörelser14,15 ,21.
Vi utvecklade en cellbaserade kontraktilitet analysmetod som recapitulates många av de cellulära svar nedströms av dimma som har observerats i utveckla flyga embryon17. Vi konstruerade en stabil S2 cellinje som uttrycker dimma taggade på sitt C-terminus med myc under kontroll av en inducerbara metallothionine arrangören som kan skördas vid tillägg av kopparsulfat (CuSO4) till medium. När dimman-villkorade media appliceras ectopically på S2 receptorer + (S2R +) celler, som är en subrad S2 celler kännetecknas av deras differentiell uttryck av receptorer såsom Frizzled och integrin subenheter, cellerna genomgår en omorganisation av den cytoskelettet starkt påminner av apikala sammandragning12,17,27,33. Dessa förändringar kan observeras genom faskontrast mikroskopi i vilken dimma behandling leder till uppkomsten av fas-dark volanger vägledande av en radiell ökning i icke-muskel myosin II kontraktilitet eller genom fluorescensmikroskopi där dimma behandling leder till den bildandet av icke-muskel myosin II ringar i celler som uttrycker andra-taggade RLC34. Dessa ringar innehåller en myosin-fosforyleras reglerande ljusslinga (pRLC) synlig via immunfärgning23,34,35. Denna dimma-inducerad svar krävs Cta, RhoGEF2, Rho och Rok; Således har använder rekombinant dimma-Myc och S2R + celler, vi etablerat ett sätt att undersöka dimma-inducerad sammandragning i en vävnad-kultur-baserat system24,25,34.
Här presenterar vi ett detaljerade protokoll för en cell-baserad kontraktilitet analys med hjälp av en cellinje för Drosophila -vävnadskultur (S2R + celler), som genomgår en icke-muskel myosin II sammandragning som svar på dimma signalering. Denna analys är användbar för att undersöka den dimma väg, samt mekanismer som reglerar icke-muskel myosin II kontraktilitet.
Cell-odling överväganden:
De villkor under vilka S2R + celler upprätthålls är avgörande för att uppnå tillförlitlig data från denna analys. När du planerar att utföra kontraktilitet analysen, det bästa att upprätthålla S2R + celler i sköld och sjöng M3 insekt medium. Medan S2R +-celler kan trivs i andra insekt cell kultur media (t.ex., SF900 eller Schneiders insekt medium), förlorar de ofta sin lyhördhet till Fog. S2R + celler som har en hög passage-nummer, i allmänhet mer än 20-25 passager, börjar förlora känslighet att RNAi. Det är bäst att använda tidig-passage celler för alla experiment. En annan viktig aspekt att RNAi utarmning experiment är att välja lämpliga kontroller. Gemensamma negativa kontroller inkluderar dsRNA riktar sig till andra eller pBlueScript, varken av som har homologi att flyga genomet. Inriktning proteiner i dimma väg (Rho, Rok, etc.), som, när utarmat, förhindra aktivering av icke-muskel myosin kontraktilitet, är också användbara kontroller. S2:fog-Myc celler kan bibehållas i en alternativa cellodlingsmedium såsom SF900 kompletteras med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, och 0,25 amfotericin B. Observera att FBS krävs inte när odling av celler i SF900. Cell densiteten är också en viktig komponent till alla aspekter av Drosophila vävnadsodling celler. Till skillnad från däggdjur vävnadsodling celler, Drosophila-härledda vävnadsodling cellerna trivs bäst under högre cell tätheter (densiteter inte lägre än 5 x 105 celler/mL). Men, när du utför detta test, det är kritiskt att cellerna inte är klädd på con-A-belagd glasbotten rätter ovan 80% confluence, som kvantifiering av kontrakterade kontra icke-kontrakterade celler blir extremt tråkiga.
Kritiska aspekter och alternativa metoder för cellulära kontraktilitet analysen:
Produktionen av dimma, liganden som utlöser icke-muskel myosin II kontraktilitet, är en nyckelkomponent i denna analys. Den dimma genen kodar ett protein av 730 aminosyror med en förutsedd molekylvikt av ~ 78 kDa26. Hydropathy analys visade på en sträcka av 12 hydrofoba rester på Fog’s amino-terminus som kunde fungera som en sekretion signal sekvens. Kodande sekvens innehåller dessutom också flera platser för potentiella N – och O-länkade glycosylation, ytterligare föreslår Fog är en utsöndrade proteinet26. Till stöd för detta, var dimma lokaliserad till sekretoriska vesikler i presumtiva epidermala celler som genomgår apikala sammandragning16. Dimma-Myc uttryck förmåddes vid tillägg av kopparsulfat till medium och antikroppar mot dimma eller Myc igen ett 150-kD protein från odlingssubstratet skördas från inducerade kulturer men inte från inducerad media från S2 celler saknar den Fog-Myc-konstruktionen. Detta molekylvikt var högre än den förutspådda 80-kD molekylvikten av dimma och föreslår att sekretoriska S2 celler kan det glycosylate proteinet innan exocytos. På grund av det potentiella variabilitet i dimma rening är det lämpligt att använda samma parti av Fog-villkorade media för alla experiment. Att göra upp stora partier av koncentrerad dimma-Myc media hjälper att upprätthålla konsekvens i hela rundor av experiment.
Framgången för denna analys beror också på att tryggt identifiera celler som har genomgått sammandragning. Medan förträngda celler kan observeras genom fluorescensmikroskopi, genom färgning för aktin eller icke-muskel myosin II, är det mest tillförlitliga sättet att identifiera och kvantifiera förträngda celler genom faskontrast eller DIC mikroskopi. Exakt antal kan uppnås med 20 X – 40 X förstoring på de flesta vanliga ljus Mikroskop. Även om protokollet skriven här använder glasbotten rätter, kan analysen också utföras med hjälp av standard 1,5 glas coverslips belagd med con A. Tillägg av Fog kan göras i 35 mm av vävnadsodling på ett täckglas placeras på parafilm, för att begränsa mängden Fog används för varje analys. Kvaliteten på fixering är en kritisk komponent i analysen, som dåligt fast celler kan leda till falskt positiva. Använder färska fixering lösning och se till att kommer att cellerna aldrig torr en gång fast leda till mer tillförlitliga resultat. Slutligen är det viktigt att räkna ett stort antal celler. Vanligtvis endast 30% – 50% av obehandlade eller kontroll RNAi-behandlade celler tygla efter perfusionen i dimma. Det finns dock en basal nivå av sammandragning som uppstår i S2R + celler, så ett stort antal celler som behövs för att säkerställa att varje förändring i fraktionen av förträngda celler beror på behandlingar. Utarmning av vissa proteiner som är involverade i regleringen av icke-muskel myosin II kontraktilitet kan dessutom leda till hyper-kontraktilitet, även i avsaknad av dimma. De data som presenteras här är från över 3 600 celler som räknades i tre successiva RNAi behandlingar med samma parti av Fog-villkorade media.
Tillämpningar av cellulära kontraktilitet analysen:
Denna kontraktilitet analys, när den kombineras med RNAi screening metoder erbjuder ett kraftfullt system för att studera cellsignalering, morfogenes och cellulära kontraktilitet. Tidigare, det har använts för att identifiera en av två dimma samtidig receptorer21. En riktad skärm av 138 G-proteinkopplade receptorer (varandra) är slut av RNAi i S2R + celler och dess förmåga att bemöta dimma var analyseras som beskrivs i det protokoll som presenteras här. Av de 138 varandra, en enda, avslöjades tidigare uncharacterized gen, som nu kallas dimma. Ytterligare utredning av funktionen av Mist visade att inte bara krävdes det för Fog-inducerad cellulära kontraktilitet i S2R +-celler, men det var också viktigt för gastrulation utveckla Drosophila21. Dessutom användes denna analys som visar att Ric-8, en icke-kanoniska GEF, är också en komponent i dimman signalering väg27. En serie epistasis RNAi experiment tillsammans med kontraktilitet analys visat att Ric-8 interagerar med Gα12/13 subenhet Cta och funktioner för att lokalisera den i cellen, som är kritisk till Fog-inducerad cellulära kontraktilitet31 .
Drosophila vävnadsodling är väl lämpad för nybörjare, som cellerna är lätt upphäll vid rumstemperatur, kräver inte CO2 eller buffrat cellodlingsmedium och är robusta så länge rätt cell kultur tätheter bibehålls. Cellulära kontraktilitet analysen utfördes framgångsrikt av avsnittet laboratorium i en grundutbildningsprogram cellbiologi kurs, där eleverna hade liten till ingen erfarenhet av odling av celler eller mikroskopi. Cellulära kontraktilitet analysen presenteras här representerar ett kraftfullt och cell-baserat verktyg som kan användas i gen upptäckt, eller för att förhöra dimman signalering utbildningsavsnitt, hjälper oss att bättre förstå utvecklingsprocesser, såsom apikala sammandragning och icke-muskel myosin II kontraktilitet, i allmänhet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka medlemmarna i Rogers labbet och Applewhite labbet, Greta Glover och studenterna i Reed Akademins våren 2018 cellulära biologi kurs, som har bidragit till utvecklingen av detta protokoll. Författarna vill dessutom tacka medlemmarna i Ritz lab för noggrant läsa och redigera Detta manuskript. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Science Foundation award nummer 716964 D.A.A. och A.R. och Reed College biologi institutionen.
S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, undergoes apical constriciton |
S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |