लेजर की सहायता से माउस निषेचित अंडे को Lentiviral जीन डिलिवरी
Summary
माउस निषेचित अंडे और प्रारंभिक चरण भ्रूण zona pellucida, एक ग्लाइकोप्रोटीन मैट्रिक्स है कि जीन वितरण के खिलाफ एक बाधा रूपों द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । यह आलेख lentiviral वैक्टर के साथ भ्रूण कोशिकाओं transduce करने के लिए और ट्रांसजेनिक चूहों बनाने के लिए एक लेजर के साथ zona वेध के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।
Abstract
Lentiviruses स्तनधारी कोशिकाओं को जीन वितरण के लिए कुशल वैक्टर हैं । transduction के बाद, lentiviral जीनोम छुरा मेजबान गुणसूत्र में शामिल किया है और संतति को पारित कर दिया है । इस प्रकार, वे स्थिर सेल लाइनों के निर्माण के लिए आदर्श वैक्टर हैं, संकेतकों के vivo वितरण में , और एक कोशिका के transduction ट्रांसजेनिक पशु बनाने के अंडे निषेचित । हालांकि, माउस निषेचित अंडे और प्रारंभिक चरण भ्रूण zona pellucida, एक ग्लाइकोप्रोटीन मैट्रिक्स है कि lentiviral जीन वितरण के खिलाफ एक बाधा रूपों द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । Lentiviruses भी zona घुसना करने के लिए बड़े हैं और आम तौर पर perivitelline गुहा में वायरल कणों के microinjection द्वारा दिया जाता है, zona और भ्रूण कोशिकाओं के बीच अंतरिक्ष. अत्यधिक कुशल प्रौद्योगिकीविदों और विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता माउस भ्रूण के लिए जीन वितरण के लिए lentiviruses के उपयोग को कम कर दिया है । यह आलेख वर्णन करता है कि माउस permeabilizing के लिए एक प्रोटोकॉल एक लेज़र के साथ zona छिद्रित अंडे निषेचित । लेजर वेध भ्रूण को किसी भी नुकसान में परिणाम नहीं है और lentiviruses जीन वितरण के लिए भ्रूण कोशिकाओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । Transduced भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट में इन विट्रो में विकसित कर सकते हैं, और अगर pseudopregnant चूहों में प्रत्यारोपित, ट्रांसजेनिक पिल्ले में विकसित. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया लेजर प्रभावी और प्रयोग करने में आसान है । lentiviruses द्वारा दिया जीन छुरा माउस भ्रूण कोशिकाओं में शामिल है और germline प्रसारणीय हैं । यह ट्रांसजेनिक चूहों कि कोई micromanipulation और निषेचित अंडे की microinjection की आवश्यकता है के निर्माण के लिए एक वैकल्पिक तरीका है ।
Introduction
इस विधि permeabilizing के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है माउस निषेचित अंडे की zona pellucida भ्रूण कोशिकाओं lentiviruses द्वारा जीन वितरण के लिए सुलभ बनाने के लिए । Lentiviruses स्तनधारी कोशिकाओं को कुशल जीन वितरण के लिए प्रकृति द्वारा डिजाइन किए हैं । वे विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित और उनके मेजबान गुणसूत्रों में lentiviral जीनोम एकीकृत1। vesicular-जी प्रोटीन2के व्यापक stomatitis के कारण ग्लाइकोप्रोटीन VSV वायरस tropism (VSV-g) के साथ रिकॉमबिनेंट lentivirus को pseudotyping करके lentiviral होस्ट कोशिकाओं की रेंज का आसानी से विस्तार किया जाता है । transduction के बाद, lentiviral जीन छुरा और एकीकृत कर रहे है उनके मेजबान गुणसूत्रों ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाने के भाग के रूप में व्यक्त की है । अगर प्रारंभिक चरण भ्रूण कोशिकाओं को दिया, lentiviral जीनोम दोहराया और पूरे जीव में व्यक्त की है । Lentiviral transduction चूहों, चूहे, चिकन, बटेर और सुअर3,4,5,6,7 transgenics की अंय प्रजातियों के बीच के उत्पादन के लिए नेतृत्व किया है । lentiviral जीन वितरण की ठेठ विधि, तथापि, कुशल तकनीशियनों और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है zona pellucida बाधा है कि जल्दी चरण भ्रूण encapsulates पर काबू पाने । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए कैसे एक लेजर का उपयोग करने के लिए lentiviral जीन वितरण की सुविधा zona permeabilize का वर्णन है ।
स्तनधारी अंडे zona pellucida जो निषेचन के बाद polyspermy के खिलाफ निषेचित अंडे की रक्षा करने के लिए और पर्यावरण8,9बातचीत की सीमा के बाद सख्त कर रहे हैं । zona एक बाधा है कि भ्रूण कोशिकाओं से दूर lentiviruses रहता है, जब तक एक ब्लास्टोसिस्ट के रूप में रची जाती हैं । सुसंस्कृत माउस निषेचित अंडे हैच 4 दिनों के बाद और pseudopregnant चूहों में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए पहले पिल्ले में सामांय विकास के लिए सेने । इसलिए, transduction के लिए, lentiviruses perivitelline गुहा, zona और भ्रूण कोशिकाओं के बीच अंतरिक्ष में zona से सेने से पहले microinjected हैं ।
zona pellucida अक्सर में के लिए हटा दिया है इन विट्रो मानव अंडे के निषेचन के लिए निषेचन दर10वृद्धि हुई है । हालांकि, रासायनिक हटाने माउस zona pellucida प्रतिकूल माउस भ्रूण विकास को प्रभावित करता है और भ्रूण कोशिकाओं11,12के लिए हानिकारक है । जीन डिलीवरी के लिए अंय तरीके माउस निषेचित अंडे कोशिका नाभिक13में डीएनए के प्रत्यक्ष microinjection द्वारा zona pellucida बाधा पर काबू पाने के । परमाणु microinjection भ्रूण को जीन पहुंचाने का एक कुशल साधन है. हालांकि, के बाद से प्रत्येक भ्रूण microinjection के लिए व्यक्तिगत रूप से जगह में आयोजित किया जाता है, अभ्यास श्रमसाध्य और एक नौसिखिया उपयोगकर्ता के लिए समय लेने जा सकता है ।
ऐसे electroporation और photoporation के रूप में अंय तरीकों क्षणिक और अल्पकालिक जीन वितरण के लिए माउस निषेचित अंडे14,15,16के लिए उपयोगी होते हैं । इन पद्धतियों बड़े पैमाने पर CRISPR-Cas9 घटकों और recombinases देने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, जीन के electroporation और photoporation डिलिवरी को transgenics बनाने के लिए कुशलतापूर्वक इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । शुक्राणु कि पंचर माउस अधिवृषण से एकत्र कर रहे है भी lentiviruses द्वारा transduced जासकता है और इन विट्रो निषेचन के लिए इस्तेमाल के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं का उत्पादन17,18,19, 20।
इस प्रोटोकॉल में, माउस भ्रूण को lentiviral जीन डिलिवरी एक लेज़र का उपयोग कर zona permeabilizing द्वारा सुविधा है । XYClone लेजर के लिए एक सहायता के रूप में विकसित किया गया था इन विट्रो निषेचन21 और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की खेती22. यह एक छोटा सा उपकरण है कि स्थापना के लिए सरल और प्रयोग करने में आसान है । एक बार एक खुर्दबीन पर स्थापित, यह एक उद्देश्य लेंस के अंतरिक्ष में रह रहे है और साथ सॉफ्टवेयर लेजर लक्ष्य के लिए अनुमति देता है, जबकि माइक्रोस्कोप eyepieces के माध्यम से देख ( प्रोटोकॉलदेखें: 3 अनुभाग) । एक बार zona XYClone लेजर द्वारा छिद्रित है, lentiviruses23जीन वितरण के लिए संस्कृति मीडिया में पेश किया जा सकता है । एकाधिक lentiviruses के लिए एक साथ गुणसूत्र निगमन के लिए कई जीन देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अलग और संस्कृति माउस निषेचित अंडे, zona pellucida के वेध के लिए लेजर का उपयोग करें दिखाता है, और lentiviruses द्वारा माउस भ्रूण कोशिकाओं के transduction दर्शाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
lentiviruses की क्षमता को अपने मेजबान जीनोम में एकीकृत उंहें स्थिर जीन वितरण के लिए एक आदर्श वेक्टर बनाता है । Lentiviral वैक्टर अप करने के लिए ले जा सकते है ८.५ kilobase जोड़ी आनुवंशिक सामग्री है कि सेल विशिष्ट या inducible प्रवर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH), राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया । हम डॉ रॉबर्ट Petrovich और पांडुलिपि और उपयोगी सलाह के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ जेसन विलियंस के आभारी हैं । हम यह भी स्वीकार करते है और डॉ. बर्न ग्लॉस, नॉकआउट कोर, फ्लो Cytometry सुविधा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर, और उनके तकनीकी योगदान के लिए NIEHS की तुलनात्मक दवा शाखा सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम तुलनात्मक चिकित्सा शाखा और सुश्री Lois Wyrick इमेजिंग केंद्र के NIEHS पर हमें तस्वीरें और चित्र के साथ उपलब्ध कराने के लिए से श्री डेविड Goulding शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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