Laser-assisteret Lentiviral gen levering til musen befrugtede æg
Summary
Mus befrugtede æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod gen levering. I denne artikel beskrives en protokol for perforering af zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og skabe Transgene mus.
Abstract
Lentiviruses er effektive vektorer genet leveres til pattedyrsceller. Efter transduktion, den lentiviral genom er stabilt indarbejdet i host-kromosom og videregives til afkom. De er derfor ideelle vektorer for oprettelsen af stabile cellelinjer, i vivo levering af indikatorer og transduktion af enkelt celle befrugtede æg til at skabe transgene dyr. Men musen befrugtet æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod lentiviral gen levering. Lentiviruses er for stort til at trænge ind i zona og leveres typisk ved mikroinjektion af virale partikler i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler. Kravet om, at højt kvalificerede teknikere og specialiseret udstyr har minimeret brugen af lentiviruses til gen levering til musen embryoner. I denne artikel beskrives en protokol for permeabilizing mus befrugtede æg ved perforering af zona med en laser. Laser-perforering medfører ikke nogen skade til embryoner og tillader lentiviruses at få adgang til embryonale celler til gen levering. Transduced embryoner kan udvikle sig til blastocyst in vitro og hvis implanteret i pseudopregnant mus, udvikle sig til transgene unger. Laser bruges i denne protokol er effektiv og nem at bruge. Gener leveret af lentiviruses stabilt indarbejde mus embryonale celler og er kønscelleoverførsel smitsomme. Dette er en alternativ metode til oprettelse af Transgene mus, der kræver ingen micromanipulation og mikroinjektion af befrugtede æg.
Introduction
Denne metode giver detaljerede instruktioner for permeabilizing zona pellucida mus befrugtede æg at gøre embryonale celler tilgængelige til gen levering af lentiviruses. Lentiviruses er designet af naturen for effektiv gen levering til pattedyrsceller. De inficerer delende og ikke-dividere celler og integrere den lentiviral genom i deres vært kromosomer1. Lentiviral vært celleområdet er let udvidet med pseudotyping den rekombinante lentivirus med vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G), på grund af den brede tropisme VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener er stabilt integreret og udtrykt som en del af deres vært kromosomer skaber et ideelt værktøj til generering af transgene dyr. Hvis leveret til tidlige fase embryonale celler, er det lentiviral genom replikeret og udtrykt i hele organismen. Lentiviral transduktion har ført til produktion af mus, rotter, kylling, vagtel og gris3,4,5,6,7 blandt andre arter af transgenics. Den typiske lentiviral gen levering, dog kræver dygtige teknikere og specialudstyr til at overvinde den zona pellucida barriere, der indkapsler de tidlige fase embryoner. Det overordnede mål med denne metode er at beskrive hvordan man permeabilize zona bruger en laser til at lette lentiviral gen levering.
Pattedyr æg er omgivet af zona pellucida, der hærder efter befrugtning at beskytte de befrugtede æg mod polyspermy og begrænse miljøvekselvirkninger8,9. Zona danner en barriere, der holder lentiviruses væk fra embryonale celler, indtil embryonerne er udklækket som en blastocyst. Kulturperler mus befrugtede æg klækkes efter 4 dage og skal implanteres i pseudopregnant mus før klækning til normale udvikling i hvalpe. Derfor, for transduktion, lentiviruses er microinjected før klækning fra zona i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler.
Zona pellucida er ofte fjernet for in vitro- befrugtning af menneskelige æg til at øge befrugtning af10. Men kemisk fjernelse af musen zona pellucida negativt påvirker mus embryo udvikling og er skadeligt for embryonale celler11,12. Andre metoder til gen levering til musen befrugtede æg overvinde zona pellucida barriere ved direkte mikroinjektion af DNA i cellen kernen13. Pronuclear mikroinjektion er et effektivt middel til at levere gener til embryoner. Da hver embryo er holdt på plads individuelt for mikroinjektion, kan praksis kan være besværlige og tidskrævende for en novice-bruger.
Andre metoder såsom elektroporation og photoporation er nyttige for flygtig og kortvarig gen levering til musen befrugtede æg14,15,16. Disse metoder er flittigt brugt til at levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Dog anvendes ikke elektroporation og photoporation levering af gener effektivt til at oprette transgenics. Sædcellerne, der er indsamlet fra punkteret mus epididymis kan også transduced af lentiviruses og anvendes til in vitro- befrugtning til at producere transgene dyr17,18,19, 20.
I denne protokol lettes lentiviral gen levering til musen embryoner ved permeabilizing zona ved hjælp af en laser. XYClone laser blev udviklet som en hjælp til in vitro- befrugtning21 og dyrkning af embryonale stamceller22. Det er et lille apparat, der er nem at setup og nem at bruge. Når først installeret på et mikroskop, det optager plads i et mål linse og den medfølgende software giver mulighed for sigter laser mens du kigger gennem mikroskop okularer (Se protokollen: afsnit 3). Når zona er perforeret af XYClone laser, kan lentiviruses indføres i Kulturmedier til gen levering23. Flere lentiviruses kan bruges samtidigt levere flere gener for kromosomale indarbejdelse.
Denne protokol vil beskrive hvordan man isolere og kultur mus befrugtede æg, illustrerer brugen af laser for perforering af zona pellucida og demonstrerer transduktion af musen embryonale celler ved lentiviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentiviruses evne til at integrere i deres vært genom gør dem en ideel vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære op til 8,5 kilobase par (kbp) af genetisk materiale, der kan rumme celle-specifikke eller inducerbar initiativtagerne, markeringen markører eller fluorescerende fraspaltning. Indbygget genomisk materiale kan replikere som en del af deres vært genom og reguleres for at udtrykke eller deaktivere på ønskede tidspunkter. Disse vektorer mulighed for spatiotemporelle kontrol over genekspres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af den murene Research Program af National Institute of Health (NIH), nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er taknemmelige for Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams kritisk læsning af manuskript og nyttige råd. Vi vil også gerne anerkende og takke Dr. Bernd Gloss, Knockout core, Flow flowcytometri facilitet, Fluorescens mikroskopi og Imaging Center og sammenlignende medicin filial faciliteter af NIEHS for deres tekniske bidrag. Vi vil gerne takke Mr. David Goulding fra grenen sammenlignende medicin og Ms. Lois Wyrick af Imaging Center på NIEHS for at forsyne os med billeder og illustrationer.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
