Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier
Summary
Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.
Abstract
Lentiviren sind effiziente Vektoren für gen-Lieferung für Säugerzellen. Nach Transduktion Lentivirale Genom ist stabil in das Host-Chromosom integriert und werden an die Nachkommen weitergegeben. Daher sind sie ideale Vektoren für die Schaffung von stabilen Zelllinien, in Vivo Lieferung von Indikatoren und Transduktion Einzelzelle befruchtete Eier transgene Tiere zu erstellen. Aber Maus befruchtete Eier und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen Lentivirale gen Lieferung bildet. Lentiviren sind zu groß, um die Zona durchdringen und werden in der Regel durch Mikroinjektion von viralen Partikel in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen geliefert. Der Bedarf an hochqualifizierten Technologen und spezialisierte Ausrüstung hat die Verwendung von Lentiviren für gen-Lieferung an Mäuseembryonen minimiert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Maus, die befruchteten Eier durch Perforation der Zona mit einem Laser permeabilizing. Laser-Perforation führt nicht Schäden an Embryonen und Lentiviren Zugriff auf embryonale Zellen für gen Lieferung ermöglicht. Ausgestrahlt Embryonen können entwickeln sich zu Blastozysten in-vitro- und wenn bei pseudopregnant Mäusen implantiert in transgenen Welpen entwickeln. Die in diesem Protokoll verwendeten Laser ist effektiv und einfach zu bedienen. Gene stabil von Lentiviren geliefert in embryonalen Mauszellen integrieren und Keimbahn übertragbare sind. Dies ist eine alternative Methode zur Erstellung von transgenen Mäusen, die keine Mikromanipulation erfordert und Mikroinjektion von befruchteten Eiern.
Introduction
Diese Methode bietet detaillierte Anweisungen für die Zona Pellucida der Maus befruchtete Eier permeabilizing embryonale Zellen von Lentiviren gen Lieferung zugänglich zu machen. Lentiviren sind naturgemäß für effiziente gen Lieferung für Säugerzellen ausgelegt. Sie trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und ihre Gastgeber Chromosomen1das Lentivirale Genom integrieren. Das Lentivirale Wirtszellen ist leicht durch Pseudotyping der rekombinanten Lentivirus mit vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G), aufgrund der breiten Tropismus des VSV-G Protein2erweitert. Nach Transduktion Lentivirale Gene stabil integriert und als Teil ihrer Host-Chromosomen schaffen ein ideales Werkzeug zur Erzeugung transgener Tiere ausgedrückt. Frühen Stadium embryonalen Zellen geliefert, das Lentivirale Genom repliziert und ausgedrückt in den gesamten Organismus. Lentivirale Transduktion hat dazu geführt, die Produktion von Mäusen, Ratten, Huhn, Wachtel und Schwein3,4,5,6,7 unter anderen Arten von gentechnisch veränderten Pflanzen. Die typische Art der Lentivirale gen Lieferung, erfordert jedoch qualifizierte Techniker und Spezialgeräte, die Zona Pellucida-Barriere zu überwinden, die die frühen Embryonen kapselt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Zona mit Hilfe eines Lasers auf um Lentivirale gen Lieferung zu erleichtern permeabilize beschreiben.
Säugetier Eier sind von der Zona Pellucida umgeben, nach Befruchtung härtet, die befruchteten Eier gegen Polyspermy zu schützen und Umweltwechselwirkungen8,9zu beschränken. Die Zona bildet eine Barriere, die Lentiviren Weg von den embryonalen Zellen hält, bis die Embryonen als Blastozyste ausgebrütet werden. Kultivierte Maus befruchteten Eiern schlüpfen nach 4 Tagen und muss in pseudopregnant Mäuse vor der Schraffur für eine normale Entwicklung in Welpen implantiert werden. Daher sind für die Transduktion, Lentiviren vor dem schlüpfen aus der Zona in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen mikroinjiziert.
Die Zona Pellucida wird oft für in-vitro- Befruchtung der menschlichen Eizellen, die Befruchtung Rate10erhöhen entfernt. Jedoch chemische Entfernung der Maus Zona Pellucida nachteilig wirkt sich auf die Entwicklung des Embryos und ist schädlich für die embryonalen Zellen11,12. Andere Methoden für die gen-Lieferung an Maus befruchtete Eier überwunden die Zona Pellucida Barriere durch direkte Mikroinjektion von DNA in die Zelle Kern13. Man Mikroinjektion ist ein effizientes Mittel zur Bereitstellung von Genen für Embryonen. Da jedes Embryo im Ort individuell für die Mikroinjektion stattfindet, kann die Praxis mühsam und zeitaufwendig für einen Neuling jedoch.
Andere Methoden wie Electroporation und Photoporation eignen sich für transiente und kurzfristige gen Lieferung an Maus befruchtete Eier14,15,16. Mit diesen Methoden sind ausführlich für die Bereitstellung von CRISPR-Cas9 Komponenten und Rekombinasen. Electroporation und Photoporation Bereitstellung von Gene jedoch kann nicht effizient zum gentechnisch veränderten Pflanzen zu schaffen. Spermien, die aus punktierten Maus Nebenhoden gesammelt werden können auch von Lentiviren ausgestrahlt und für in-vitro- Befruchtung verwendet, um transgene Tiere17,18,19, zu produzieren 20.
In diesem Protokoll wird die Lentivirale gen Lieferung an Mäuseembryonen durch permeabilizing der Zona mit Hilfe eines Lasers erleichtert. Die XYClone Laser wurde als Hilfsmittel für in-vitro- Befruchtung21 und Anbau von embryonalen Stammzellen22entwickelt. Es ist ein kleiner Apparat, der einfach zu installieren und einfach zu bedienen ist. Einmal installiert am Mikroskop, es den Raum von einem Objektiv nimmt und die mitgelieferte Software ermöglicht mit dem Ziel des Lasers beim Blick durch das Mikroskop Okulare (siehe Protokoll: Abschnitt 3). Sobald die Zona vom XYClone Laser perforiert ist, können die Nährmedien für gen Lieferung23Lentiviren eingeführt. Mehreren Lentiviren könnte verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Gene für chromosomale Integration liefern.
Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie zu isolieren und Kultur Maus Eier befruchtet, veranschaulicht die Verwendung der Laser für die Perforation der Zona Pellucida und zeigt die Signalweiterleitung Maus embryonalen Zellen von Lentiviren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit der Lentiviren, in deren Wirtsgenom integrieren macht sie einen idealen Vektor für stabile gen Lieferung. Lentivirale Vektoren können bis zu 8,5 Kilobase paar (Kbp) des genetischen Materials führen, die zellspezifische oder induzierbaren Promotern, Selektionsmarker oder fluoreszierende Moieties aufnehmen können. Eingearbeitete genomische Material kann als Bestandteil ihrer Wirtsgenom replizieren und zu äußern oder zu gewünschten Zeitpunkten deaktivieren geregelt werden. Diese Vektoren ermöglichen r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Intramural Research Program des National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt. Wir sind dankbar, Dr. Robert Petrovich und Dr. Jason Williams für kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Ratschläge. Wir möchten auch anerkennen und Dr. Bernd Gloss, der Ko-Kern, Flow Cytometry Anlage, die Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Center und die vergleichende Medizin Zweig Einrichtungen des NIEHS für ihre technische Beiträge danken. Wir möchten danken Mr David Goulding aus dem vergleichenden Medizin Zweig und Frau Lois Wyrick des Imaging Center bei NIEHS für die uns mit Fotos und Illustrationen.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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