Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova
Summary
Mouse di uova fecondate ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene. Questo articolo descrive un protocollo per la zona di perforazione con un laser per trasdurre cellule embrionali con vettori lentivirali e creare topi transgenici.
Abstract
Lentivirus sono efficienti vettori per la consegna del gene in cellule di mammifero. A seguito di trasduzione, il genoma lentivirale stabile è incorporato nel cromosoma ospite ed è passato sopra alla progenie. Pertanto, essi sono vettori ideale per la creazione di linee cellulari stabilizzate, in vivo consegna degli indicatori e trasduzione di uova di singola cellula fecondata per creare animali transgenici. Tuttavia, mouse fecondato uova ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene lentivirali. Lentivirus sono troppo grandi per penetrare la zona e sono in genere consegnati dal microinjection di particelle virali in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali. Il requisito per i tecnologi altamente qualificati e attrezzature specializzate è ridotto al minimo l’uso di lentivirus per consegna del gene di embrioni di topo. Questo articolo descrive un protocollo per permeabilizing le uova fecondata del mouse di perforare la zona con un laser. Perforazione laser non comporta alcun danno agli embrioni e permette lentivirus ottenere l’accesso alle cellule embrionali per consegna del gene. Trasdotte embrioni possono svilupparsi in blastocisti in vitro e se impiantati nei topi pseudopregnant, svilupparsi in cuccioli transgenici. Il laser utilizzato in questo protocollo è efficace e facile da usare. Geni consegnati da lentivirus stabile incorporano nelle cellule embrionali di topo e sono germinale trasmissibile. Si tratta di un metodo alternativo per la creazione di topi transgenici che non richiede nessun micromanipolazione e microiniezione di uova fecondate.
Introduction
Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per permeabilizing la zona pellucida di uova fecondata mouse per rendere le cellule embrionali accessibile per la consegna del gene di lentivirus. Lentivirus sono progettati dalla natura per la consegna efficiente del gene in cellule di mammifero. Essi infettano le cellule di divisione e divisione e integrare il genoma lentivirale nella loro ospite cromosomi1. La gamma delle cellule dell’ospite lentivirali prontamente viene espanso dal pseudotipizzazione il lentivirus ricombinanti con la glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSV-G), dovuto il vasto trofismo della proteina VSV-G2. A seguito di trasduzione, geni lentivirali sono stabilmente integrati ed espresso come parte del loro cromosomi ospite creando uno strumento ideale per la generazione di animali transgenici. Se consegnato alle prime cellule embrionali di fase, il genoma lentivirale è replicato ed espresso nell’intero organismo. Trasduzione lentivirale ha portato alla produzione di ratto, topi, quaglie, pollo e maiale3,4,5,6,7 , tra le altre specie di transgenica. Il tipico metodo di consegna del gene lentivirali, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e tecnici specializzati di superare la barriera di zona pellucida che incapsula gli embrioni in fase precoce. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere come permeabilize la zona usando un laser per facilitare la consegna del gene lentivirali.
Le uova dei mammiferi sono circondate dalla zona pellucida che indurisce dopo fertilizzazione per proteggere le uova fecondate contro gamete e per limitare le interazioni ambientali8,9. La zona costituisce una barriera che allontana le cellule embrionali lentivirus fino a quando gli embrioni sono nati come una blastocisti. Coltivati del topo fecondate le uova si schiudono dopo 4 giorni e devono essere impiantati in topi pseudopregnant prima schiusa per lo sviluppo normale in cuccioli. Pertanto, per la trasduzione, lentivirus vengono microiniettati prima della schiusa dalla zona in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali.
La zona pellucida viene spesso rimosso per fecondazione in vitro di ovuli umani per aumentare il tasso di fertilizzazione10. Tuttavia, rimozione chimica di mouse zona pellucida negativamente colpisce lo sviluppo dell’embrione di topo ed è nociva per le cellule embrionali11,12. Altri metodi per la consegna del gene di uova fecondata mouse superare la barriera di zona pellucida di microiniezione diretta del DNA nella cellula nucleo13. Microiniezione pronuclei è un mezzo efficace di fornire geni agli embrioni. Tuttavia, poiché ogni embrione è tenuto in posizione singolarmente per la microiniezione, la pratica può essere laborioso e che richiede tempo per un utente inesperto.
Altri metodi quali l’elettroporazione e photoporation sono utili per transitori e a breve termine consegna del gene di topo fecondato uova14,15,16. Questi metodi sono ampiamente utilizzati per la consegna di ricombinasi e componenti CRISPR-Cas9. Tuttavia, elettroporazione e photoporation consegna dei geni non utilizzabile in modo efficiente per creare transgenica. Gli spermatozoi che vengono raccolti da epididimo forato del mouse possono anche essere microlavorati lentivirus e utilizzati per la fecondazione in vitro per la produzione di animali transgenici17,18,19, 20.
In questo protocollo, la consegna del gene lentivirali di embrioni di topo è facilitata da permeabilizing la zona utilizzando un laser. Il laser XYClone è stato sviluppato come sussidio per la coltivazione di cellule staminali embrionali22e in vitro fertilizzazione21 . Si tratta di un piccolo apparecchio che è semplice da configurare e facile da usare. Una volta installata su un microscopio, occupa lo spazio di una lente obiettiva e il software in dotazione permette di puntamento laser mentre guardando attraverso gli oculari del microscopio (Vedi protocollo: sezione 3). Una volta che la zona è perforata dal laser XYClone, lentivirus può essere introdotto nel terreno di coltura per gene consegna23. Lentivirus multiple potrebbero essere utilizzati per inviare simultaneamente diversi geni per costituzione cromosomica.
Questo protocollo descriverà come isolare e cultura mouse fecondato uova, viene illustrato l’utilizzo del laser per perforazione della zona pellucida e dimostra la trasduzione di cellule embrionali di topo da lentivirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di integrare nel loro genoma ospite il lentivirus li rende un vettore ideale per consegna stabile del gene. Vettori lentivirali possono trasportare fino a 8,5 paio di kilobase (kbp) di materiale genetico che può ospitare promotori cellula-specifico o inducibili, marcatori di selezione o moiety fluorescente. Materiale genomico incorporato può replicare come parte del loro genoma ospite e regolato per esprimere o disattivare a intervalli di tempo desiderato. Questi vettori consentono un controllo spatiotempo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institute of Health (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS). Siamo grati al Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams per una lettura critica del manoscritto e consigli utili. Inoltre vorremmo citare e ringraziare il Dr. Bernd Gloss, il nucleo di Knockout, la struttura di citometria a flusso, la microscopia a fluorescenza e Imaging Center e le strutture di ramo di medicina comparativa del NIEHS per i loro contributi tecnici. Vorremmo ringraziare Mr. David Goulding dal ramo di medicina comparativa e MS. Lois Wyrick di Imaging Center presso il NIEHS per averci fornito con fotografie e illustrazioni.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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