마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란
Summary
수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
Lentiviruses는 포유류 세포에 유전자 배달에 대 한 효율적인 벡터. 변환, 다음 lentiviral 게놈은 안정적으로 호스트 염색체에 통합 하 고 자손 전달 됩니다. 따라서, 그들은 안정 된 세포의 생성, 지표, vivo에서 배달 및 유전자 변형 동물을 만드는 단일 셀 수정 된 달걀의 변환에 대 한 이상적인 벡터. 그러나, 마우스 수정 된 계란 및 초기 단계 배아 zona pellucida, lentiviral 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. Lentiviruses 너무 커서는 zona 침투 하 고 perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에 바이러스 성 입자의 microinjection에 의해 일반적으로 전달 됩니다. 고도로 숙련 된 기술자와 전문된 장비에 대 한 요구 사항을 마우스 배아에 유전자 배달 lentiviruses 사용 하 여를 최소화 했다. 이 문서는 레이저로는 zona 꿰뚫기에 의해 수정 된 마우스 달걀 permeabilizing 위한 프로토콜을 설명 합니다. 레이저 구멍 뚫 기 손해 태아를 초래 하지 않습니다 하 고 배아 세포에 유전자 배달에 대 한 액세스는 lentiviruses를 허용 한다. 불리고 배아 blastocyst 생체 외에서 로 발전 하 고 pseudopregnant 마우스에 이식 하는 경우 유전자 변형 새끼로 발전 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 레이저는 효과적이 고 사용 하기 쉬운. 유전자는 lentiviruses 안정적으로 전달 마우스 배아 세포로 통합 하 고 생식 전송 됩니다. 필요 없는 micromanipulation 유전자 변형 생쥐의 생성 및 수정 된 난 자의 microinjection에 대 한 대체 방법입니다.
Introduction
이 메서드는 lentiviruses에 의해 배아 세포 유전자 배달을 위한 액세스할 수 있도록 마우스 수정 된 달걀의 zona pellucida permeabilizing에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다. Lentiviruses는 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달에 대 한 자연에 의해 설계 되었습니다. 그들은 나누어 및 비 분열 세포를 감염 하 고 그들의 호스트 염색체1에 lentiviral 게놈을 통합. Lentiviral 호스트 셀 범위는 쉽게 확장 pseudotyping VSV G 단백질2의 광범위 한 차 있는 굴곡 운동으로 인해 vesicular 구내 염 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 재조합 lentivirus. 변환, 다음 lentiviral 유전자는 안정적으로 통합 하 고 그들의 호스트 염색체 유전자 변형 동물을 생성 하기 위한 이상적인 도구를 만들기의 일환으로 표현. 초기 단계 배아 세포에 전달 하는 경우 lentiviral 게놈 복제 이며 전체 유기 체에 표현. Lentiviral 변환 쥐, 쥐, 닭, 메 추 라 기의 생산을 주도하 고 있다 고3,,45,,67 제 닉의 다른 종 중 돼지. 그러나 Lentiviral 유전자 전달의 일반적인 방법, 숙련 된 기술자 및 특수 장비 초기 단계 배아를 캡슐화 하는 zona pellucida 장벽을 극복 하기 위해 필요 합니다. 이 방법의 전반적인 목표 permeabilize lentiviral 유전자 납품을 촉진 하기 위하여 레이저를 사용 하 여 구역 하는 방법을 설명 하는 것입니다.
포유류 계란 zona pellucida는 polyspermy에 대 한 수정 된 알을 보호 하 고 환경 상호 작용8,9제한 수정에 따라 견고 하 게 둘러싸여 있습니다. 구역까지 태아는 blastocyst로 부 화는 lentiviruses 배아 세포에서 유지 하는 방 벽을 형성 한다. 교양된 마우스 4 일 후 계란 해치를 수정 하 고 pseudopregnant 쥐 새끼로 정상적인 개발을 위한 부 화 이전에 이식 해야 합니다. 따라서, 변환, lentiviruses perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에는 구역에서 부 화 하기 전에 microinjected는.
Zona pellucida 종종 수정 속도10증가 인간의 계란의 체 외에서 수정에 대 한 제거 됩니다. 그러나, 마우스 zona pellucida의 화학 제거 부정적인 마우스 배아 개발에 영향을 하 고는 배아 세포11,12. 마우스 수정 된 달걀에 유전자 배달에 대 한 다른 방법 DNA의 세포 핵13에 직접 microinjection에 의해 zona pellucida 방 벽 극복. Pronuclear microinjection는 태아를 유전자를 전달 하는 효율적인 방법 이다. 그러나, 각 배아는 개별적으로 microinjection에 대 한 장소에서 개최 됩니다, 이후 연습 힘들고 초보자 사용자에 대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.
Electroporation 및 photoporation 등 다른 방법을 과도에 유용 하며 마우스를 단기 유전자 전달 수정 된 달걀14,,1516. 이러한 방법은 광범위 하 게 recombinases CRISPR-Cas9 구성 요소를 제공 하는 데 사용 됩니다. 그러나, electroporation 그리고 photoporation 유전자의 배달 제 닉 생성을 효율적으로 사용할 수 없습니다. 구멍이 마우스 epididymis에서 수집 된 정 충 수 또한 lentiviruses에 의해 불리고 하 고 체 외에서 수정에 대 한 유전자 변형 동물17,,1819, 를 생산 하는 데 사용 20.
이 프로토콜에서 마우스 배아를 lentiviral 유전자 배달 permeabilizing 레이저를 사용 하 여 구역에 의해 촉진 된다. XYClone 레이저는 체 외에서 수정21 와22배아 줄기 세포 경작에 대 한 지원으로 개발 되었다. 그것은 설치 프로그램을 간단 하 고 사용 하기 쉬운 작은 기구 이다. 현미경에 설치, 그것은 대물 렌즈의 공간을 차지 하 고 동반 소프트웨어는 현미경 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 레이저를 목표에 대 한 허용 ( 프로토콜참조: 3 절). zona XYClone 레이저 천공은, 일단 lentiviruses 유전자 배달23문화 미디어에 소개 될 수 있습니다. 여러 lentiviruses 염색체 설립에 대 한 여러 유전자를 동시에 제공 하 사용 될 수 있습니다.
이 프로토콜을 분리 하는 방법을 설명 합니다 및 문화 마우스 수정 된 계란, zona pellucida의 천공에 대 한 레이저의 사용을 보여 줍니다 lentiviruses로 마우스 배아 세포의 변환 방법을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그들의 호스트 게놈으로 통합 하는 lentiviruses의 능력은 그들이 안정적인 유전자 배달에 대 한 이상적인 벡터 합니다. Lentiviral 벡터 셀 또는 유도할 수 있는 발기인, 선택 표시, 또는 형광 moieties 수용할 수 있는 유전 물질의 최대 8.5 kilobase 쌍 (kbp)을 수행할 수 있습니다. 법인된 게놈 자료 그들의 호스트 게놈의 일환으로 복제할 수 고를 표현 하거나 원하는 시간 지점에서 비활성화할 통제 될. 이러한 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 연구소의 건강 (NIH), 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 로버트 페트 로비치와 박사 제이슨 윌리엄스는 원고 및 유용한 조언의 중요 한 독서에 대 한 감사입니다. 우리 또한 인정 하 고 박사 베른트 광택, 녹아웃 코어, Cytometry 교류 시설, 형광 현미경 및 이미징 센터, 그들의 기술적인 기여는 NIEHS의 비교 약 분기 시설 감사 하 고 싶습니다. 우리는 비교 약 지점에서 미스터 데이비드 Goulding와 사진 및 일러스트와 함께 우리를 제공 하기 위한 NIEHS에 이미징 센터의 양 로이스 Wyrick 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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