Laser-assistert Lentiviral gen levering til musen befruktede egg
Summary
Mus befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot gen levering. Denne artikkelen beskriver en protokoll for perforating i zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og opprette transgene mus.
Abstract
Lentiviruses er effektiv vektorer for gen levering til pattedyrceller. Etter transduction, lentiviral genomet er stabilt integrert i det vert kromosomet og sendes videre til avkom. Dermed er de ideelle vektorer for etablering av stabil cellelinjer, i vivo levering av indikatorer og Albin på én celle befruktet egg til å opprette transgene dyr. Men musen befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot lentiviral gen levering. Lentiviruses er for store til å trenge zona og er vanligvis levert av microinjection av virus partikler i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler. Behovet for svært dyktige teknikere og spesialisert utstyr har minimert bruken av lentiviruses genet levering til mouse embryoer. Denne artikkelen beskriver en protokoll for permeabilizing musen befruktet egg av perforating i zona med en laser. Laser-perforering resultere ikke i skade å embryoer og lar lentiviruses å få tilgang til embryonale celler for gen levering. Transduced embryo kan utvikle seg til blastocysten i vitro, og hvis implantert i pseudopregnant mus, utvikle seg til transgene pups. Laseren som brukes i denne protokollen er effektivt og brukervennlig. Gener levert av lentiviruses stabilt innlemme i mus embryonale celler og er germline overført. Dette er en alternativ metode for oppretting av transgene mus som krever ingen micromanipulation og microinjection av befruktet egg.
Introduction
Denne metoden gir detaljerte instruksjoner for permeabilizing zona pellucida musen befruktet egg å gjøre embryonale celler tilgjengelig for gen levering av lentiviruses. Lentiviruses er designet av naturen for effektiv gen levering til pattedyrceller. De infisere dele og ikke dele celler og integrere lentiviral genomet i deres vert kromosomene1. Lentiviral vert celleområdet utvides lett ved pseudotyping av rekombinant lentivirus med vesicular stomatitt virus glykoprotein (VSV-G), på grunn av den brede tropism VSV-G protein2. Etter transduction, lentiviral gener er stabilt integrert og uttrykt som en del av deres vert kromosomene skaper et ideelt verktøy for generering av transgene dyr. Hvis leveres til tidlig stadium embryonale celler, er lentiviral genomet replikert og uttrykt i hele organismen. Lentiviral signaltransduksjon har ført til at mus, rotte, kylling, Vaktel, og gris3,4,5,6,7 blant andre arter av transgenics. Den typiske metoden for lentiviral gen levering, men krever dyktige teknikere og spesialisert utstyr for å overvinne den zona pellucida barrieren som omslutter de tidlig stadium embryoene. Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive hvordan permeabilize zona bruker en laser til å lette lentiviral gen levering.
Pattedyr egg er omgitt av den zona pellucida som stivner etter befruktning å beskytte befruktede egg mot polyspermy og begrense miljømessige interaksjoner8,9. Zona danner en barriere som holder lentiviruses fra embryonale celler før embryoene er klekket som en blastocyst. Kultivert musen befruktede eggene klekkes etter 4 dager og må bli implantert i pseudopregnant mus før klekking for normal utvikling i pups. Derfor for transduction, er lentiviruses microinjected før klekking fra zona i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler.
Den zona pellucida er ofte fjernet for i vitro befruktning av menneskelig egg å øke befruktning rate10. Imidlertid kjemiske fjerning av musen zona pellucida negativt påvirker musen embryo utvikling og er skadelig for embryonale celler11,12. Andre metoder for gen levering til musen befruktet egg overvinne zona pellucida barrieren av direkte microinjection DNA i cellen kjernen13. Pronuclear microinjection er en effektiv måte å levere gener til embryoer. Siden hver embryoet holdes på plass for microinjection, kan imidlertid praksis arbeidskrevende og tidkrevende for en nybegynner.
Andre metoder som electroporation og photoporation er nyttig for forbigående kortsiktige gen levering til musen befruktet egg14,15,16. Disse metodene er mye brukt for å levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Imidlertid kan ikke electroporation og photoporation levering av gener brukes effektivt til å opprette transgenics. Spermatozoa som er samlet inn fra punktert musen bitestikkel kan også transduced av lentiviruses og gjelder i vitro fertilisering produsere transgene dyr17,18,19, 20.
I denne protokollen, er lentiviral gen levering til mouse embryoer tilrettelagt av permeabilizing zona ved hjelp av en laser. XYClone laser ble utviklet som et hjelpemiddel i vitro fertilisering21 og dyrking av embryonale stamceller22. Det er en liten apparater som er enkel å konfigurere og enkel å bruke. Når installert på et mikroskop, det opptar for en linsen og den medfølgende programvaren tillater sikter laser mens du ser gjennom mikroskop okularene (se protokoll: avsnitt 3). Når zona er perforert av XYClone laser, kan lentiviruses bli introdusert i kultur media for gen levering23. Flere lentiviruses kan brukes samtidig levere flere gener for chromosomal innlemmelse.
Denne protokollen vil beskrive hvordan du isolerer og kultur mus befruktede egg, illustrerer bruken av laser for perforering av zona pellucida, og demonstrerer signaltransduksjon mus embryonale celler ved lentiviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evne til lentiviruses å integrere deres vert genomet gjør dem en ideell vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære opptil 8,5 kilobase par (kbp) av genetisk materiale som rommer celle-spesifikke eller induserbart arrangører, markørene eller fluorescerende moieties. Genomisk materiale replikeres som del av deres vert genom og reguleres uttrykkelig eller deaktivere på ønsket tidspunkt. Disse vektorer tillate spatiotemporal kontroll over genuttrykk på ulike stadier av utvikling og merkevare lentivi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er takknemlige til Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams for kritisk lesing av manuskriptet og nyttige råd. Vi ønsker også å erkjenne og takker Dr. Bernd Gloss, Knockout kjernen, Flow cytometri anlegget, fluorescens mikroskopi og Imaging Center og komparativ medisin gren fasiliteter i NIEHS for deres teknisk bidrag. Vi vil gjerne takke Mr. David Goulding i sammenlignende medisin grenen og Ms. Lois Wyrick av Imaging Center på NIEHS for å gi oss med bilder og illustrasjoner.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
