Доставки при помощи лазера лентивирусные ген мыши оплодотворенные яйца
Summary
Мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против Джин доставки. Эта статья описывает протокол для перфорации zona с лазером для передают эмбриональных клеток с лентивирусные векторы и создания трансгенных мышей.
Abstract
Lentiviruses являются эффективным векторов для доставки гена в mammalian клетках. После трансдукции лентивирусные генома стабильно включены в хромосоме хост и передается потомству. Таким образом они являются идеальным векторов для создания стабильных клеточных линий, в естественных условиях доставки показателей и трансдукция одноклеточного оплодотворенных яиц для создания трансгенных животных. Однако мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против лентивирусные гена доставки. Lentiviruses слишком велики, чтобы проникнуть zona и обычно поставляются микроинъекции вирусных частиц в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток. Потребность в высококвалифицированных технологов и специализированного оборудования свести к минимуму использование lentiviruses для доставки генов эмбрионов мыши. Эта статья описывает протокол для permeabilizing мыши оплодотворенные яйца, перфорации zona с помощью лазера. Лазерная перфорация не приводят к любой ущерб эмбрионов и позволяет lentiviruses для получения доступа к эмбриональных клеток для доставки генов. Transduced эмбрионы могут развиться в бластоцисты в пробирке и если имплантированы в мышей, pseudopregnant, перерасти в трансгенных щенков. Лазер, используемый в настоящем Протоколе, эффективный и простой в использовании. Гены, поставляемые lentiviruses стабильно инкорпорировать в мышиных эмбриональных клеток и являются инфекционными микрофлорой. Это альтернативный метод для создания трансгенных мышей, которая требует не микроманипуляции и микроинъекции оплодотворенных яиц.
Introduction
Этот метод предоставляет подробные инструкции сделать доступными для доставки генов эмбриональных клеток, lentiviruses для permeabilizing вителлинового мыши оплодотворенных яиц. Lentiviruses созданным природой для доставки эффективного гена в mammalian клетках. Они заразить деления и не деления клетки и интегрировать их принимающих хромосомы1лентивирусные генома. Диапазон ячеек, лентивирусные узла легко расширяется pseudotyping рекомбинантных человека с гликопротеина вирус везикулярного стоматита (VSV-G), из-за широкого тропизм белка VSV-G2. После трансдукции лентивирусные гены являются стабильно интегрированы и выразили в рамках их принимающих хромосом, создавая идеальный инструмент для создания трансгенных животных. Если доставлены на ранней стадии эмбриональных клеток, лентивирусные генома реплицируется и выражена в весь организм. Лентивирусные трансдукции привела к производству мышей, крыс, курица, перепела и свиней3,4,5,6,7 среди других видов мутация. Типичный способ доставки лентивирусные гена, однако, требует квалифицированных техников и специализированное оборудование для преодоления вителлинового барьер, который инкапсулирует эмбрионы ранней стадии. Общая цель этого метода является описывают разрушения zona, с помощью лазера для облегчения доставки лентивирусные ген.
У млекопитающих яйца окружены zona pellucida, которая твердеет после оплодотворения для защиты оплодотворенных яиц против polyspermy и ограничить экологических взаимодействий8,9. Zona образует барьер, который удерживает lentiviruses от эмбриональных клеток до тех пор, пока эмбрионы вылупились как бластоциста. Культивированный мыши оплодотворенные яйца люк после 4 дней и должен быть имплантированы в pseudopregnant мышей до вылупления для нормального развития в детенышей. Таким образом для трансдукции, lentiviruses microinjected до вылупления из zona в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток.
Zona pellucida часто удаляется в пробирке оплодотворение яйцеклетки человека увеличить скорость оплодотворение10. Однако химическое удаление мыши вителлинового отрицательно влияет на развитие эмбриона мыши и вредно для эмбриональных клеток11,12. Другие методы для доставки ген мыши оплодотворенные яйца преодолеть барьер вителлинового прямого микроинъекции ДНК в ядре клетки13. Pronuclear микроинъекции является эффективным средством доставки гены эмбрионов. Однако поскольку каждый эмбрион удерживается на месте индивидуально для микроинъекции, практика может быть трудоемким и требует много времени для начинающего пользователя.
Другие методы, такие как электропорации и photoporation являются полезными для переходных и краткосрочные поставки ген мыши оплодотворенные яйца14,,1516. Эти методы широко используются для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и recombinases. Однако электропорация и photoporation доставки генов не может эффективно использоваться для создания мутация. Сперматозоидов, которые собираются из пробитого мыши придатка яичка также могут быть преобразованы в lentiviruses и используется для оплодотворения в пробирке для производства трансгенных животных17,18,19, 20.
В этом протоколе лентивирусные гена доставки эмбрионов мыши способствует permeabilizing зона, с помощью лазера. XYClone лазер был разработан для помощи в пробирке оплодотворение21 и культивирование эмбриональных стволовых клеток22. Это небольшой аппарат, который прост в установке и прост в использовании. После того, как установлен на микроскопе, он занимает пространство объектива и сопровождающих программное обеспечение позволяет для направленного лазерного глядя через окуляры микроскопа (см. протокол: раздел 3). После zona Перфорированная лазером XYClone, lentiviruses могут быть введены в культуру СМИ для доставки генов23. Несколько lentiviruses могут использоваться одновременно поставить несколько генов для регистрации хромосом.
Этот протокол будет описывать как изолировать и культуры мыши оплодотворенные яйца, иллюстрирует использование лазерной перфорации zona pellucida и демонстрирует трансдукции мышиных эмбриональных клеток, lentiviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentiviruses способность интегрироваться в их геном принимающей делает их идеальным вектор для доставки стабильного ген. Лентивирусные векторы могут нести до 8,5 kilobase пары (kbp) генетического материала, который может вместить клеток конкретных или индуцибельной промоутеров, маркеры выделения…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано очной программе исследований Национального института здравоохранения (НИЗ), Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS). Мы благодарны д-р Роберт Петрович и доктор Джейсон Уильямс для критических чтении рукописи и полезные советы. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить д-р Бернд глянец, нокаут ядро, поток цитометрии фондом, микроскопии флуоресцирования и центр томографии и сравнительные ветвь медицины услуги NIEHS для их технический вклад. Мы хотели бы поблагодарить г-н Дэвид Гулдинг от сравнительной ветвь медицины и г-жа Лоис Вириком из центра изображения на NIEHS за предоставленную нам с фотографиями и иллюстрациями.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
