Entrega de Gene lentivirales asistida por láser ratón huevos fertilizados
Summary
Ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene. Este artículo describe un protocolo para perforar la zona con un láser para transducir las células embrionarias con vectores lentivirales y crear ratones transgénicos.
Abstract
Lentiviruses son eficientes vectores para la entrega de genes a células de mamíferos. Después de transducción, el genoma lentivirales estable se incorpora en el cromosoma del huésped y se pasa a la progenie. Así, son vectores ideales para la creación de líneas celulares estables, en vivo entrega de indicadores y transducción de los huevos sola célula fertilizada para crear animales transgénicos. Sin embargo, ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene lentivirales. Lentiviruses son demasiado grandes para penetrar en la zona y por lo general son entregados por microinyección de partículas virales en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias. El requisito para tecnólogos altamente capacitados y equipo especializado ha minimizado el uso de lentiviruses para la entrega de genes a los embriones de ratón. Este artículo describe un protocolo para permeabilizing los huevos fertilizado de ratón por la zona de perforación con láser. Perforación del laser no produce ningún daño a los embriones y permite lentiviruses acceder a las células embrionarias para la entrega del gene. Transduced embriones pueden convertirse en blastocistos in vitro y si implantados en ratones seudopreñadas, convertirse en crías transgénicas. El láser utilizado en este protocolo es eficaz y fácil de usar. Entregado por lentivirus estable los genes incorporan células embrionarias de ratón y son germinales transmisibles. Se trata de un método alternativo para la creación de ratones transgénicos que no requiere micromanipulación y microinyección de huevos fertilizados.
Introduction
Este método proporciona instrucciones detalladas para permeabilizing la zona pelúcida de los huevos fertilizado de ratón para acercar a las células embrionarias para la entrega del gene por lentivirus. Lentiviruses son diseñados por naturaleza para la entrega eficaz de genes a células de mamíferos. Infectar células divisorias y no se dividen e integrar el genoma lentivirales su anfitrión cromosomas1. La gama de las células del huésped lentivirales se expande fácilmente por pseudotyping los lentivirus recombinante con la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), debido al amplio tropismo del VSV-G proteína2. Después de transducción, lentivirales genes estable están integrados y expresados como parte de sus cromosomas de host creando una herramienta ideal para la generación de animales transgénicos. Si se entrega a las células embrionarias de la etapa temprana, el genoma lentivirales es replica y expresa en todo el organismo. Transducción de lentivirales ha llevado a la producción de ratones, rata, pollo, codorniz y cerdo3,4,5,6,7 entre otras especies de transgénicos. El método típico de la entrega del gene lentivirales, sin embargo, requiere de técnicos especializados y equipo especializado para superar la barrera de la zona pelúcida que encapsula los embriones de etapa temprana. El objetivo general de este método es describir cómo permeabilizar la zona usando un laser para facilitar la entrega del gene lentivirales.
Huevos de mamíferos están rodeados por la zona pelúcida que se endurece después de fertilización para proteger los huevos fertilizados contra polyspermy y limitar las interacciones ambientales8,9. La zona forma una barrera que aleja de lentiviruses las células embrionarias hasta que los embriones están sombreados como blastocisto. Cultivado ratón fertilizado los huevos traman después de 4 días y debe ser implantado en ratones seudopreñadas antes de incubación para el desarrollo normal en los cachorros. Por lo tanto, para la transducción, los lentiviruses son microinyectados antes de la eclosión de la zona en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias.
La zona pelúcida se quita a menudo para fertilización in vitro de óvulos humanos para aumentar la tasa de fertilización del10. Sin embargo, remoción química de ratón zona pelúcida adversamente afecta el desarrollo del embrión de ratón y es perjudicial para las células embrionarias11,12. Otros métodos para la entrega de genes en huevos fertilizado de ratón superan la barrera de la zona pelúcida por microinyección directa de ADN en el núcleo de la célula del13. Microinyección pronuclear es un medio eficaz de entrega de genes a los embriones. Sin embargo, puesto que cada embrión se lleva a cabo en el lugar individualmente para microinyección, la práctica puede ser laborioso y desperdiciador de tiempo para un usuario novicio.
Otros métodos como la electroporación y photoporation son útiles para transitorio y a corto plazo entrega de genes ratón fertilizado huevos14,15,16. Estos métodos son ampliamente utilizados para la entrega de recombinasas y CRISPR Cas9 componentes. Sin embargo, electroporación y photoporation entrega de genes no puede utilizarse eficazmente para crear transgénicos. Espermatozoides que se recogen del epidídimo de ratón pinchado también pueden ser transduced por lentivirus y utilizados para la fertilización in vitro para producir animales transgénicos17,18,19, 20.
En el presente Protocolo, la entrega del gene lentivirales a embriones de ratón facilita permeabilizing la zona utilizando un láser. El láser de XYClone fue desarrollado como una ayuda para el cultivo de células madre embrionarias22y en vitro fecundación21 . Es un aparato pequeño que es fácil de configurar y fácil de usar. Una vez instalado en un microscopio, que ocupa el espacio de un objetivo y permite que el software que lo acompaña para apuntar el láser mientras mira a través de los oculares del microscopio (ver Protocolo: la sección 3). Una vez que la zona está perforado por el láser de XYClone, lentivirus pueden introducirse en los medios de cultivo para gene entrega23. Lentiviruses múltiples podrían utilizarse para ofrecer simultáneamente varios genes cromosómicos incorporación.
Este protocolo describe cómo aislar y cultura ratón huevos fertilizados, muestra el uso del laser para la perforación de la zona pelúcida y demuestra la transducción de células embrionarias de ratón por lentivirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de los lentivirus para integrarse en su genoma de host hace un vector ideal para genes estable. Vectores lentivirales pueden llevar hasta 8,5 pares del kilobase (kbp) de material genético que puede acomodar a promotores celulares específicos o inducibles, marcadores o moléculas fluorescentes. Incorporado material genómico puede replicar como parte de su genoma huésped y regularse para expresar o desactivar en puntos de tiempo deseado. Estos vectores permiten control spatiotemporal sobre expresión géni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS). Agradecemos al Dr. Robert Petrovich y Dr. Jason Williams lectura crítica del manuscrito y consejos útiles. También nos gustaría reconocer y agradecer a Dr. Bernd Gloss, el núcleo de octavos de final, el servicio de citometría de flujo, la microscopía de fluorescencia y centro de la imagen y las instalaciones de la rama de medicina comparativa de la NIEHS por sus contribuciones técnicas. Nos gustaría agradecer al Sr. David Goulding desde la rama de medicina comparativa y la Sra. Lois Wyrick del centro de la imagen en el NIEHS por facilitarnos fotografías e ilustraciones.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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