Laser-assisted Lentiviral gen leverans till mus befruktade ägg
Summary
Mus befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot gen leverans. I artikeln beskrivs ett protokoll för perforering av zona med laser transduce embryonala celler med lentiviral vektorer och skapa transgena möss.
Abstract
Lentiviruses är effektiva vektorer för gen leverans till däggdjursceller. Efter transduktion, lentiviral genomet är stabilt införlivas med kromosomen värd och förs vidare till avkomman. Således, är de idealiska vektorer för skapandet av stabila cellinjer, i vivo leverans av indikatorer och transduktion enda cell befruktade ägg att skapa transgena djur. Men musen befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot lentiviral gen leverans. Lentiviruses är för stora för att tränga in i zona och levereras vanligtvis av Mikroskop av viruspartiklar in perivitelline kaviteten, avståndet mellan zona och embryonala celler. Kravet på högutbildade tekniker och specialutrustning har minimerat användningen av lentiviruses för gen leverans till musembryon. I artikeln beskrivs ett protokoll för permeabilizing mus befruktade ägg av perforering i zona med laser. Laserperforering resulterar inte i någon skada embryon och tillåter lentiviruses att få tillgång till embryonala celler för gen leverans. Sensorik embryon kan utvecklas till blastocysten in vitro och om implanteras i pseudopregnant möss, utvecklas till transgena pups. Den laser som används i detta protokoll är effektiv och lätt att använda. Gener som levereras av lentiviruses stabilt införliva mus embryonala celler och är könsceller överförbara. Detta är en alternativ metod för skapandet av transgena möss som kräver ingen mikromanipulation och Mikroskop av befruktade ägg.
Introduction
Denna metod ger detaljerade anvisningar för permeabilizing zona pellucida mus befruktade ägg att göra embryonala celler tillgängligt för gen leverans genom lentiviruses. Lentiviruses är designad av naturen för effektiv gen leverans till däggdjursceller. De infektera avdelande och icke-dela celler och integrera deras värd kromosomerna1lentiviral genomet. Lentiviral värd cellintervallet utökas lätt genom pseudotyping den rekombinanta lentivirus med den vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSV-G), på grund av den breda tropism av VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener är stabilt integrerat och uttryckt som del av deras värd kromosomer skapar ett idealiskt verktyg för att generera transgena djur. Om levereras till tidiga skede embryonala celler, lentiviral genomet replikeras och uttryckt i hela organismen. Lentiviral transduktion har lett till produktionen av möss, råttor, kyckling, vaktel och gris3,4,5,6,7 bland andra arter av transgenics. Den typiska lentiviral gen leverans, dock kräver skickliga tekniker och specialutrustning för att övervinna den zona pellucida barriär som kapslar in de tidiga skede embryona. Det övergripande målet med denna metod är att beskriva hur man permeabilize de zona använder en laser för att underlätta lentiviral gen leverans.
Däggdjur ägg är omgivna av zona pellucida som stelnar efter befruktning att skydda de befruktade äggen mot polyspermy och begränsa miljösamspel8,9. Zona bildar en barriär som håller lentiviruses borta från de embryonala cellerna tills embryon har kläckts som en blastocyst. Odlade mus befruktade äggen kläcks efter 4 dagar och måste implanteras i pseudopregnant möss före kläckningen för normal utveckling till valpar. Därför för transduktion, är lentiviruses microinjected före kläckningen från zona in i det perivitelline hålet, avståndet mellan zona och embryonala celler.
Zona pellucida är ofta bort för in vitro- befruktning av ägg från människa att öka de befruktning ränta10. Dock kemisk borttagning av mus zona pellucida negativt påverkar mus embryots utveckling och är skadligt för embryonala celler11,12. Andra metoder för genterapi leverans till mus befruktade ägg övervinna zona pellucida barriären av direkta Mikroskop av DNA i cellen kärna13. Pronukleär Mikroskop är ett effektivt sätt att leverera gener till embryon. Eftersom varje embryo hålls på plats individuellt för Mikroskop, kan praxis dock mödosamt och tidskrävande för en novis användare.
Andra metoder såsom elektroporation och photoporation är användbara för övergående och kortvariga gen leverans till mus befruktade ägg14,15,16. Dessa metoder används i stor utsträckning för att leverera CRISPR-Cas9 komponenter och rekombinaser. Elektroporation och photoporation leverans av gener inte kan dock användas effektivt skapa transgenics. Spermier som samlas in från punkterad mus bitestiklarna kan också sensorik av lentiviruses och används för in vitro- befruktning för att producera transgena djur17,18,19, 20.
I detta protokoll underlättas lentiviral gen leverans till musembryon av permeabilizing i zona med hjälp av en laser. XYClone lasern utvecklades som ett stöd för in vitro- fertilisering21 och odling av embryonala stamceller22. Det är en liten apparat som är enkel att installera och lätt att använda. En gång installerat på ett mikroskop, det upptar utrymmet av en objektiv och den medföljande programvaran tillåter för att sikta lasern medan du tittar i Mikroskop okularen (se protokoll: avsnitt 3). När zona är perforerad av XYClone lasern, kan lentiviruses införas i kultur media för gen leverans23. Flera lentiviruses kunde användas samtidigt leverera flera gener för kromosomala iblandning.
Detta protokoll ska beskriva hur man isolera och kultur mus befruktade ägg, illustrerar användningen av laser för perforering av zona pellucida och visar transduktion mus embryonala celler av lentiviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentiviruses förmåga att integrera i sin värd genomet gör dem en idealisk vektor för stabil gen leverans. Lentiviral vektorer kan bära upp till 8,5 kilobase par (kbp) av genetiskt material som kan rymma-specifika eller inducerbara initiativtagare, markörerna eller fluorescerande beståndsdelarna. Bolagiserade genomisk material kan replikeras som en del av sin värd genomet och regleras för att uttrycka eller inaktivera vid önskade tidpunkter. Dessa vektorer Tillåt för spatiotemporal kontroll över genuttryck i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi är tacksamma att Dr. Robert Petrovich och Dr Jason Williams för kritisk läsning av manuskript och användbara råd. Vi vill också erkänna och tacka Dr. Bernd Gloss, Knockout kärnan, Flow flödescytometri anläggningen, den fluorescensmikroskopi och Imaging Center och jämförande medicin gren anläggningar i NIEHS för deras tekniska bidrag. Vi vill tacka Mr David Goulding från grenen jämförande medicin och Ms. Lois Wyrick för Imaging Center vid NIEHS för att förse oss med fotografier och illustrationer.
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
