Изготовление анизотропной полимерного искусственного антиген представляющих клеток для CD8 + Т-клеток активации
Summary
Здесь мы представляем протокол для герметизации и быстро генерировать биологически вдохновил, биологически articifical антиген представляющих клеток (aAPC) с перестраиваемой размер, форму и представление поверхности белка для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях .
Abstract
Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) являются перспективной платформой для иммунной модуляции вследствие их мощной способностью стимулировать Т-клеток. Бесклеточной субстратов предлагают ключевые преимущества над на основе ячеек aAPC, включая точный контроль параметров сигнала презентации и физические свойства поверхности aAPC чтобы модулировать его взаимодействия с Т-клеток. aAPC построены из анизотропных частиц, особенно эллипсоидальными частицами, было показано, чтобы быть более эффективным, чем связаться с их сферических коллегами на стимулирование Т-клеток, за счет расширения привязки и больше площадь поверхности для Т-клеток, а также как снижение неспецифической поглощения и расширенной фармакокинетические свойства. Несмотря на повышенный интерес к анизотропной частиц даже широко методы генерации анизотропной частицы, такие как растяжения тонкопленочных может быть сложным для реализации и использования можно воспроизвести.
С этой целью мы описать протокол для быстрого, стандартизированные изготовления биологически анизотропной aAPC на основе частиц с перестраиваемой размер, форма и сигнал презентации для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях, а также методы для характеризовать их размер, морфология и поверхностных белков содержание и оценить их функциональность. Такой подход к фабрикации анизотропной aAPC является масштабируемой и воспроизводимости, что делает его идеальным для генерации aAPC для «стандартных» immunotherapies.
Introduction
Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) показали обещание как иммуномодулирующих агентов, потому что они могут генерировать ответ надежные антиген специфические Т-клеток. Важное значение для этих платформ являются их способность эффективно представит решающую сигналов для активации Т-клеток. Бесклеточной aAPC являются привлекательной альтернативой на основе ячеек aAPC, потому что они легче и дешевле в изготовлении, сталкиваются с меньшими проблемами во время масштабирования и перевод и смягчить риски, связанные с лечения на основе ячеек. Бесклеточной aAPC также обеспечить высокую степень контроля над представления параметров сигнала и физические свойства поверхности, которая будет взаимодействовать с клетками T1.
aAPC должны охарактеризовать как минимум двух сигналов, необходимых для активации Т-клеток. Сигнал 1 обеспечивает антигены и происходит, когда Т-клеточных рецепторов (TCR) признает и осуществляет взаимодействие с MHC класса I или II, с учетом его родственных антигена, кульминацией сигнализации через TCR комплекс. Чтобы обойти требование конкретизации антигена, aAPC систем часто несут агонистических моноклональные антитела против CD3-рецептор, который nonspecifically стимулирует TCR комплекс. Рекомбинантные формы MHC, особенно MHC мультимеры, также используются на поверхности aAPC предоставлять антигена специфика2,3. Сигнал 2 это костимуляторных сигнал, который направляет деятельность Т-клеток. Предоставлять костимуляции, необходимые для активации клеток T, рецептор CD28 обычно стимулируется с агонистических антитела представлены на поверхности aAPC, хотя другие костимуляторных рецепторов, таких как 4-1BB были успешно целевых4. Сигнал 1 и 2 белки обычно лишенных подвижности на поверхности жестких частиц синтезировать aAPC. Исторически aAPC были изготовлены из различных материалов, в том числе полистирола4,5 и Железо декстран6. Новые системы используют биоразлагаемые полимеры как поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA) для создания aAPC, который может легко сочетаться сигнал белки, подходят для прямого управления в естественных условияхи могут облегчить стабильного выпуска инкапсулированные цитокинов или растворимых факторов для расширения Т-клеток активации7,8.
В дополнение к наличие необходимых сигналов белков рецептор взаимодействие через достаточно большой площади поверхности во время взаимодействия клеток aAPC/T имеет важное значение для активации клеток T. Таким образом физические параметры aAPC, такие как размер и форма резко изменить их доступных площадь контакта и влияет на их способность стимулировать клетки T. Микронных размеров aAPC показали должна быть более эффективной в стимулировании Т-клеток, чем их коллеги наноразмерных9,10. Однако нано aAPC может иметь Улучшенный накопление и лучше дренаж на лимфатические узлы, которые могут повысить их производительность в vivo над микро aAPC11. Форма является другой переменной интерес в системах на основе частиц aAPC. Анизотропные aAPC недавно было показано, быть более эффективным, чем изотропной частиц на стимулирование Т-клеток, главным образом благодаря укреплению взаимодействия с сочетании с снижение неспецифической клеток поглощения клеток-мишеней. Клетки преференциально связывают к длинной оси эллипсоидальными частицами, и больший радиус кривизны и плоской поверхности позволяют больше контакта между aAPC и12Т-клеток. Длинная ось эллипсоидальными частицами также препятствует фагоцитоза, что приводит к времени увеличенная циркуляция, по сравнению с сферических частиц, следуя в естественных условиях администрации12,13. Учитывая все эти преимущества эллипсоидальными частицами посредником большее расширение антиген специфические T клетки в пробирке и в естественных условиях по сравнению с сферических частиц, эффект наблюдается как микро, так и nanoscales12, 13. Существуют различные стратегии для изготовления анизотропной частицы, но тонкопленочных растяжения является простым, широко признанным метод, используемый для создания целого ряда различных частиц формы14. После синтеза частицы брошен в фильмах и растягивается в одном или двух измерениях при температуре выше температуры стеклования частиц материала. Затем фильм растворяется для извлечения частиц. Несмотря на растущий интерес к анизотропной частиц, текущие подходы для изготовления на основе частиц aAPC в основном ограничиваются изотропной систем и методы изменения формы частиц может быть трудно осуществить, несовместимые с определенным aAPC синтез стратегии и отсутствие точности и воспроизводимости15. Нашу технику растяжения тонкопленочных может быть выполнена вручную или в автоматическом режиме быстро сформировать анизотропной частицы, синтезированных из целого ряда биоразлагаемых полимеров, растягивается до желаемой пропорции в один или два размеры15.
Основываясь на нашей предыдущей работы, мы разработали биологически подход на основе частиц, в сочетании с масштабируемой растяжения тонкопленочной технологии быстро генерировать aAPC с перестраиваемой размер и форму в стандартизованном виде для Т-клеток расширения ex vivo или в VIVO. Наша стратегия спряжение белка может использоваться для пара любые белки интерес к карбоксильных групп на поверхности частиц на желаемой плотности, давая этой системы aAPC высокую степень гибкости. Мы также описывают методы характеризуют размер, морфология и поверхностных белков содержание aAPC и оценить их функциональность в пробирке. Этот протокол может быть легко адаптирована для расширения иммунные клетки ex vivo или в естественных условиях для различных иммунотерапевтических приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол подробности универсальным методом для точного поколения анизотропной полимерных частиц. Тонкая пленка, растяжения техники, описанные здесь, масштабируемые, воспроизводимые и недорогой. Альтернативные методы для генерации анизотропной частицы страдают от многих ограни…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ВКО (DGE-1746891) и KRR (DGE-1232825) Спасибо программа NSF исследовательских стипендий для поддержки. Оперативной памяти благодаря национальной исследовательской службы премии NIH NCI F31 (F31CA214147) и достижение награды для стипендий коллежа ученых для поддержки. Авторы благодарят NIH (R01EB016721 и R01CA195503), исследования, чтобы предотвратить слепоту Джеймс и Кэрол бесплатно Катализатор премии и Институт УДХ Bloomberg-Kimmel рака иммунотерапия для поддержки.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
