सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के लिए कोशिकाओं को पेश अनिसोट्रोपिक बहुलक कृत्रिम प्रतिजन का निर्माण
Summary
यहाँ, हम जल्दी और reproducibly उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद जैविक रूप से प्रेरित, biodegradable articifical प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) के साथ स्वरित्र आकार, आकार, और सतह प्रोटीन के लिए प्रस्तुति टी सेल विस्तार पूर्व विवो या vivo में .
Abstract
कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) प्रतिरक्षा मॉडुलन टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए अपने शक्तिशाली क्षमता के कारण के लिए एक होनहार मंच हैं । Acellular सब्सट्रेट सेल-आधारित aAPC पर प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें संकेत प्रस्तुति पैरामीटर और aAPC सतह के भौतिक गुणों को टी कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत का नियमन करने के लिए सटीक नियंत्रण शामिल है । aAPC अनिसोट्रोपिक कणों, विशेष रूप से ellipsoidal कणों से निर्माण किया गया है, को और अधिक प्रभावी होने के लिए अपने गोलाकार समकक्षों से प्रेरित टी कोशिकाओं के कारण बढ़ बाध्यकारी और बड़ा सतह क्षेत्र टी सेल संपर्क के लिए उपलब्ध है, के रूप में अच्छी तरह से दिखाया गया है के रूप में कम विशिष्ट और बढ़ी pharmacokinetic गुण बढ़ाया । अनिसोट्रोपिक कणों में वृद्धि की रुचि के बावजूद, अनिसोट्रोपिक कणों जैसे पतली फिल्म टूटती पैदा करने के भी व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते तरीकों को लागू करने और reproducibly का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।
इस अंत करने के लिए, हम तेजी से, मानकीकृत निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन biodegradable अनिसोट्रोपिक कण के साथ aAPC आधारित स्वरित्र आकार, आकार, और संकेत प्रस्तुति के लिए टी सेल विस्तार पूर्व vivo या vivo में, के साथ तरीकों के साथ उनके आकार, आकृति विज्ञान, और सतह प्रोटीन सामग्री की विशेषता है, और उनकी कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए । अनिसोट्रोपिक aAPC के निर्माण के लिए यह दृष्टिकोण स्केलेबल और reproducible है, यह aAPC के लिए “बंद-the-शेल्फ” immunotherapies पैदा करने के लिए आदर्श बना ।
Introduction
वे एक मजबूत antigen-विशिष्ट T कक्ष प्रतिसाद जनरेट कर सकते हैं, क्योंकि कृत्रिम antigen प्रस्तुत कक्ष (aAPC) इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंट्स के रूप में वादा दिखाया है । इन प्लेटफार्मों के लिए आवश्यक अपनी कुशलता से टी सेल सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण संकेत मौजूद हैं । Acellular aAPC सेल-आधारित aAPC के लिए एक आकर्षक विकल्प हैं क्योंकि वे आसान और कम महंगा बनाना, स्केल-अप और अनुवाद के दौरान कम चुनौतियों का सामना करना, और सेल आधारित उपचारों के साथ जुड़े जोखिम को कम करना है । Acellular aAPC भी संकेत प्रस्तुति मापदंडों पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के लिए अनुमति देते हैं और सतह के भौतिक गुण है कि टी कोशिकाओं के साथ इंटरफेस होगा1.
aAPC टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक दो संकेतों की एक ंयूनतम दोहराऊंगा चाहिए । संकेत 1 प्रतिजन मांयता प्रदान करता है और तब होता है जब टी सेल रिसेप्टर (TCR) पहचानता है और एक MHC वर्ग मैं या द्वितीय इसके cognate प्रतिजन असर, TCR परिसर के माध्यम से संकेतन में समापन के साथ संलग्न है । antigen विशिष्टता आवश्यकता को बायपास करने के लिए, aAPC सिस्टंस अक्सर CD3 रिसेप्टर, जो विशेष रूप से TCR जटिल उत्तेजित करता है के खिलाफ एक agonistic मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भालू । MHC के रिकॉमबिनेंट रूपों, विशेष रूप से MHC multimers, भी aAPC की सतह पर इस्तेमाल किया गया है प्रतिजन विशिष्टता2,3प्रदान करते हैं । संकेत 2 टी सेल गतिविधि डायरेक्ट करता है कि एक costimulatory संकेत है । टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक costimulation प्रदान करने के लिए, CD28 रिसेप्टर आम तौर पर aAPC सतह पर प्रस्तुत एक agonistic एंटीबॉडी के साथ उत्तेजित है, हालांकि अन्य costimulatory रिसेप्टर्स जैसे 4-1BB सफलतापूर्वक4लक्षित किया गया है. सिग्नल 1 और 2 प्रोटीन आमतौर पर विश्लेषित aAPC को कठोर कणों की सतह पर मैटीरियल है । ऐतिहासिक, aAPC polystyrene4,5 और लौह dextran6सहित सामग्री की एक किस्म से गढ़े गए हैं । नए सिस्टम पाली की तरह biodegradable पॉलिमर का उपयोग (लैक्टिक-co-glycolic एसिड) (PLGA) aAPC है कि आसानी से प्रोटीन संकेत करने के लिए युग्मित किया जा सकता उत्पंन करने के लिए, vivo मेंप्रत्यक्ष प्रशासन के लिए उपयुक्त हैं, और की निरंतर जारी की सुविधा कर सकते है समझाया साइटोकिंस या घुलनशील कारकों टी सेल सक्रियण7,8बढ़ाने के लिए ।
आवश्यक संकेत प्रोटीन की उपस्थिति के अलावा, aAPC/टी सेल बातचीत के दौरान एक पर्याप्त बड़ी सतह क्षेत्र पर रिसेप्टर सगाई टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, आकार और आकार के रूप में aAPC के भौतिक मापदंडों काफी उनके उपलब्ध संपर्क क्षेत्र में परिवर्तन और उनके टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने की क्षमता को प्रभावित करते हैं । माइक्रोन-आकार aAPC अपने नेनो समकक्षों9,10से टी कोशिकाओं उत्तेजक में अधिक प्रभावी होना दिखाया गया है । हालांकि, नैनो-aAPC लिम्फ नोड्स है कि माइक्रो aAPC11पर vivo में उनके प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए बेहतर हो सकता है और अधिक वितरण जल निकासी हो सकती है । आकृति कण-आधारित aAPC सिस्टमों में रुचि का एक और चर है । अनिसोट्रोपिक aAPC हाल ही में कम गैर विशिष्ट कोशिका के साथ मिलकर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बढ़ाया बातचीत की वजह से, उत्तेजक टी कोशिकाओं पर आइसोट्रोपिक कणों की तुलना में अधिक प्रभावी होना दिखाया गया है । कोशिकाओं को तरजीही ellipsoidal कणों की लंबी धुरी को बांध, और वक्रता और चापलूसी सतह के बड़े त्रिज्या aAPC और टी सेल12के बीच अधिक संपर्क के लिए अनुमति देते हैं । ellipsoidal कणों की लंबी धुरी भी phagocytosis हतोत्साहित, में वृद्धि परिसंचरण समय में जिसके परिणामस्वरूप vivo प्रशासन12,13 में निंनलिखित गोलाकार कणों की तुलना में । इन फायदों की वजह से, ellipsoidal कणों की अधिक से अधिक विस्तार मध्यस्थता में प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं और इन विट्रो में गोलाकार कणों की तुलना में vivo , एक प्रभाव दोनों माइक्रो और nanoscales12पर मनाया, 13. वहां विभिंन रणनीतियों के लिए अनिसोट्रोपिक कणों बनाना है, लेकिन पतली फिल्म टूटती एक सरल, व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है विभिंन कण आकार14की एक श्रृंखला उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । संश्लेषण के बाद, कणों फिल्मों में डाली और कण सामग्री के गिलास संक्रमण के तापमान के ऊपर एक तापमान पर एक या दो आयामों में फैला रहे हैं । फिल्म तो कणों को पुनः प्राप्त करने के लिए भंग है. अनिसोट्रोपिक कणों में बढ़ती रुचि के बावजूद, कण आधारित aAPC के निर्माण के लिए वर्तमान दृष्टिकोण ज्यादातर आइसोट्रोपिक प्रणालियों के लिए सीमित हैं, और कण आकार बदलने के तरीकों को लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है, कुछ aAPC संश्लेषण के साथ असंगत रणनीतियों, और कमी परिशुद्धता और reproducibility15। हमारी पतली फिल्म खींच तकनीक मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित फैशन में प्रदर्शन किया जा सकता है तेजी से अनिसोट्रोपिक biodegradable पॉलिमर की एक किस्म से संश्लेषित कणों उत्पंन, एक या दो आयाम15में एक वांछित पहलू अनुपात को बढ़ाकर ।
हमारे पिछले काम के आधार पर, हम एक biodegradable कण आधारित स्केलेबल पतली फिल्म खींच प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त तेजी से स्वरित्र आकार और टी सेल विस्तार के लिए एक मानकीकृत फैशन में आकार के साथ aAPC उत्पंन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित पूर्व vivo या में vivo. हमारे प्रोटीन विकार रणनीति एक वांछित घनत्व पर कण की सतह पर carboxyl समूहों के लिए ब्याज की किसी भी प्रोटीन (ओं) को जोड़ा जा सकता है, इस aAPC प्रणाली लचीलापन के एक उच्च डिग्री दे रही है । हम भी आकार, आकृति विज्ञान, और aAPC की सतह प्रोटीन सामग्री, और इन विट्रो मेंउनकी कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए तरीकों का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को आसानी से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विस्तार पूर्व vivo या vivo में immunotherapeutic आवेदनों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल अनिसोट्रोपिक बहुलक कणों की सटीक पीढ़ी के लिए एक बहुमुखी विधि का विवरण । पतली फिल्म खींच तकनीक यहां वर्णित स्केलेबल, अत्यधिक reproducible और सस्ती है । अनिसोट्रोपिक कणों पैदा करने के लिए वैकल्पिक …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (डीजीई-१७४६८९१) और KRR (डीजीई-१२३२८२५) ने समर्थन के लिए NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम का धन्यवाद किया । राम धन्यवाद राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार NIH NCI F31 (F31CA214147) और उपलब्धि के लिए कॉलेज के वैज्ञानिकों फैलोशिप समर्थन के लिए पुरस्कार । लेखकों ने NIH (R01EB016721 और R01CA195503), दृष्टिहीनों को रोकने के लिए शोध करने वाले जेम्स एण्ड Carole फ्री उत्प्रेरक पुरस्कार, और सहायता के लिए कैंसर Kimmel के लिए झळ ब्लूमबर्ग-Immunotherapy इंस्टिट्यूट को धन्यवाद दिया ।
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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