異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工
Summary
ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.
Abstract
人工抗原提示細胞 (aAPC) は、T 細胞を刺激するために強力な能力による免疫変調の有望なプラットフォームです。無細胞基板は、信号プレゼンテーション パラメーターの正確な制御と T 細胞との相互作用を調節する aAPC 表面の物理的性質などを含む細胞ベースの aAPC 上重要な利点を提供しています。異方性粒子から構成されて aAPC 特に楕円体粒子結合の増加と T 細胞の大きい表面積のための刺激的な T 細胞の球形対応連絡先としてもより効果的であることが示されています。非特異的取り込みと強化された薬物動態特性を減少。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず実装および再現性をもって使用する薄膜のストレッチが困難になるなど、異方性粒子を生成する方法をも広く受け入れ。
このため、我々 は可変のサイズ、形状を持つ生分解性異方性粒子ベース aAPC の急速な標準化された作製のためのプロトコルを記述して T 細胞拡張前のヴィヴォまたは生体内で、方法と一緒にプレゼンテーションを信号サイズ、形態、およびコンテンツ、表面蛋白質を特徴付けるその機能を評価します。異方性 aAPC の製造へのこのアプローチは、スケーラブルかつ再現可能な作って、aAPC「市販」免疫療法のための生成に理想的です。
Introduction
彼らは堅牢な抗原特異的 T 細胞応答を生成できるため、人工抗原提示細胞 (aAPC) は免疫調節剤として約束を示しています。これらのプラットフォームに不可欠な効率的に T 細胞の活性化のための重要な信号を提示するという機能です。容易で安価を作製、スケール アップと翻訳の間に少ない課題に直面し、細胞ベースの治療に関連付けられているリスクを軽減するため、無細胞 aAPC、セルベース aAPC に魅力的な代替手段です。無細胞 aAPC は信号プレゼンテーション パラメーター制御の高度と T セル1に接続されます。 表面の物理的性質を有効にできます。
aAPC は、T 細胞の活性化に不可欠な 2 つの信号の最小値を要約する必要があります。シグナル 1 は、抗原認識を提供し、T 細胞受容体 (TCR) を認識し、MHC クラス I または II の同種の抗原を軸受を介して複雑な TCR シグナリングで最高潮に達する従事し場合に発生します。抗原特異性要件をバイパスするには、aAPC システムはしばしば特異的 TCR 複合体を刺激する CD3 受容体に対するアゴニスト抗体を負担します。MHC、特に MHC 多量の組換えの形態は、抗原特異性2,3を提供するために、aAPC の表面に使用されています。信号 2 は T 細胞の活動を指示する共刺激シグナルです。共刺激が引き起こす T 細胞の活性化に必要なを提供するために 4-1 bb など他の共刺激受容体が正常にターゲットを絞った4をされているが、CD28 受容体は一般的に aAPC 表面アゴニスト抗体で刺激されます。1 と 2 の信号タンパク質 aAPC を合成する剛体粒子の表面に通常固定されています。歴史的に、aAPC はポリスチレンの4、5と鉄デキストラン6を含む、材料の様々 なでつくられています。新しいシステムは利用するポリ (乳酸グリコール酸) のような生分解性ポリマー (PLGA) aAPC 蛋白質に信号を簡単に結合することができます、生体内直接管理に適しているとの持続的な放出を促進することができますを生成するにはサイトカインや可溶性因子 T 細胞活性化7、8を強化するためにカプセル化されます。
必要な信号蛋白質の存在に加え aAPC/T 細胞間相互作用の中に十分に大きい面積で受容体関与は T 細胞の活性化に不可欠です。したがって、aAPC のサイズや形状などの物理的なパラメーターを大幅にその接触面積を変更し、T 細胞を刺激するために彼らの能力に影響を与えます。ミクロン サイズ aAPC 刺激 T 細胞で、ナノスケールの対応9,10よりも効果的であることが示されています。しかし、ナノ aAPC は優れた体内分布および可能性があります、パフォーマンス強化体内にマイクロ aAPC11リンパ節よりよい排水を持つことができます。形状は、aAPC の粒子ベース システムへの関心の別の変数です。異方性 aAPC は最近刺激 T 細胞, と標的細胞の減らされた非特異的細胞取り込みと相まって強化された相互作用による主に等方性粒子よりもより効果的に示されています。細胞は優先的に楕円体粒子の長軸をバインドし、平坦なサーフェスの曲率半径を大きく aAPC と T 細胞の12のより多くの接触を可能にします。楕円体粒子の長軸は、貪食能、次の体内管理12,13球状粒子と比較して高められた循環時間の結果を落胆させます。これらの利点のため楕円体粒子仲介抗原特異的 T 細胞体外と体内の球形の粒子と比較しての拡大効果は観測マイクロおよびナノスケールの回路の両方で12、 13。異方性粒子を製造するための様々 な戦略がありますが、多様な粒子形状14の範囲を生成するために使用シンプルで広く受け入れられている方法は、薄膜のストレッチします。次の合成、粒子は映画にキャスト、粒子材料のガラス転移温度以上の温度で 1 つまたは 2 つの次元で伸びる。フィルム粒子を取得するために溶かします。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず加工粒子ベース aAPC の現在のアプローチは等方性システムに制限されてほとんどと粒子形状を変更する方法は、実装が困難な特定 aAPC 合成と互換性がありません。戦略と精度と再現性の欠如15。当社の薄膜のストレッチ法は、手動で実行または急速に様々 な生分解性高分子から合成される異方性粒子を生成するための自動化された方法で 1 つまたは 2 つの次元のための15で必要な縦横比に拡大できます。
生分解性の粒子ベースのアプローチで急速に aAPC 可変サイズと形状を生成する T 細胞の拡大前のヴィヴォまたはのための標準化された方法でスケーラブルな薄膜ストレッチ技術と相まって開発した従来の仕事に基づいて、vivo。この aAPC システムに高度な柔軟性を与える目的の密度の粒子表面にカルボキシル基と関心の任意の蛋白を結合する蛋白質活用戦略を使用できます。サイズ、形態、表面蛋白質、aAPC のコンテンツを評価し、その機能の in vitro評価法についても述べる。このプロトコルは、展開前のヴィヴォ免疫細胞や生体内でさまざまな免疫療法のアプリケーションのために容易に適応することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、異方性高分子粒子の正確な生成のため汎用性の高い方法を詳しく説明します。ここで説明する手法を伸ばして薄い膜がスケーラブルな高い再現性で安価です。異方性粒子を生成するための代替技術はコストが高い、低いスループット、および限られた粒を含む多くの制限に苦しみます。薄膜のアプローチをストレッチは、合成後に異方性粒子が変更されるため有利である?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (DGE-1746891)、KRR (DGE-1232825) サポートの NSF 大学院研究フェローシップ プログラムをありがとうございます。RAM のおかげで国立研究サービス賞を受賞 NIH NCI F31 (F31CA214147) とサポートの大学科学者フェローシップの成果報酬です。著者に感謝 (R01EB016721 と R01CA195503) の NIH、失明ジェームスの防止およびキャロル無料カタリスト賞、研究サポートのためがん免疫療法のビジネスキャリー ブルームバーグ キンメル所。
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
