Her presenterer vi en protokoll for å raskt og reproduserbar generere biologisk inspirert, biologisk nedbrytbart articifical antigen presentere celler (aAPC) med tunable størrelse, form og overflate protein presentasjon for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo .
Kunstig antigen presentere celler (aAPC) er en lovende plattform for immun moduleringshjul potente evne til å stimulere T celler. Acellular underlag tilbyr hovedfordelene over cellen-basert aAPC, inkludert presis kontroll over signal presentasjon parametere og fysiske egenskaper aAPC overflaten å modulere sin interaksjon med T-celler. aAPC konstruert av Anisotrop partikler, spesielt ellipsoidisk partikler, har vist seg å være mer effektivt enn deres sfærisk kolleger på stimulerende T celler økt binding og større areal tilgjengelig for T celle kontakter, samt som redusert uspesifikke opptak og forbedret farmakokinetiske egenskapene. Til tross for økt interesse Anisotrop partikler, akseptert selv allment metoder for å generere Anisotrop partikler som tynn-film strekker kan være utfordrende å implementere og bruke reproduserbar.
Dette vi beskriver en protokoll for rask, standardisert fabrikasjon av biologisk nedbrytbart Anisotrop partikkel-basert aAPC med tunable størrelse, form, og signalisere presentasjon for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo, samt metoder for å karakterisere deres størrelse, morfologi og overflate protein innhold, og for å vurdere funksjonaliteten. Denne tilnærmingen å fabrikere Anisotrop aAPC er skalerbare og reproduserbar, gjør det ideelt for å generere aAPC for “sokkel” immunotherapies.
Kunstig antigen presentere celler (aAPC) har vist lovende som immunmodulerende fordi de kan generere en robust antigen-spesifikke T celle respons. Viktig for disse plattformene er deres evne til å effektivt presentere avgjørende signaler for T celle aktivering. Acellular aAPC er et attraktivt alternativ til cellen-basert aAPC fordi de er enklere og mindre kostnadskrevende å dikte færre utfordringer under oppskalering og oversettelse og lindre risikoen forbundet med cellen-basert behandling. Acellular aAPC også gi rom for en høy grad av kontroll over signal presentasjon parametere og fysiske egenskaper av overflaten som vil grensesnitt med T celler1.
aAPC må recapitulate minst to signaler nødvendig for T celle aktivering. Signal 1 gir antigen anerkjennelse og oppstår når den T-celle reseptoren (TCR) gjenkjenner og engasjerer med en MHC, klasse I eller II bærer sin beslektet antigen, kulminerte i signalering gjennom TCR komplekset. For å omgå antigen spesifisitet kravet, bære aAPC systemer ofte en agonistic monoklonalt antistoff mot CD3 reseptoren, som nonspecifically stimulerer TCR komplekset. Rekombinant former av MHC, spesielt MHC multimers, har også blitt brukt på overflaten av aAPC for å gi antigen spesifisitet2,3. 2 er et costimulatory signal som fører T celle aktivitet. For å gi costimulation nødvendig for T celle aktivering, stimuleres generelt CD28 reseptoren med et agonistic antistoff presentert på aAPC overflaten, selv om andre costimulatory reseptorer som 4-1BB har vært vellykket målrettet4. Signalet 1 og 2 proteiner er vanligvis immobilisert på overflaten av stive partikler å syntetisere aAPC. AAPC har historisk fabrikkert fra en rekke materialer, inkludert polystyren4,5 og jern dekstran6. Nyere systemer benytte biologisk nedbrytbare polymerer som poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) til å generere aAPC som lett kan kombineres for å signalisere proteiner, er egnet for direkte administrasjon i vivoog kan forenkle vedvarende utgivelsen av innkapslet cytokiner eller løselig faktorer å øke T celle aktivering7,8.
Tilstedeværelsen av nødvendig signal proteiner er reseptor engasjement over et tilstrekkelig stort område under aAPC/T celle interaksjon nødvendig for T celle aktivering. Dermed fysiske parametere i aAPC som størrelse og form drastisk endre deres tilgjengelige kontakt området og påvirke deres evne til å stimulere T celler. Mikron-størrelse aAPC vist seg å være mer effektiv på stimulerende T celler enn deres nanoskala kolleger9,10. Nano-aAPC kan imidlertid ha overlegen biodistribution og bedre drenering til lymfeknutene som kan øke sin ytelse i vivo over mikro-aAPC11. Figuren er en annen variabel interesse partikkel-baserte aAPC systemer. Anisotrop aAPC har nylig vist å være mer effektiv enn isotropic partikler på stimulerende T-celler, hovedsakelig på grunn av forbedret interaksjon med målet celler kombinert med redusert uspesifisert celle opptak. Cellene binder fortrinnsvis seg til den lange aksen ellipsoidisk partikler, og større radius av kurvatur og flatere overflaten tillater mer kontakt mellom aAPC og T-celler12. Den lange aksen ellipsoidisk partikler også fraråder fagocytose, noe som resulterer i økt sirkulasjon tid i forhold til sfæriske partikler etter i vivo administrasjon12,13. På grunn av disse fordelene megle ellipsoidisk partikler større utvidelse av antigen-spesifikke T celler i vitro og i vivo sammenlignet sfæriske partikler, en effekt observert både mikro og nanoscales12, 13. Det er ulike strategier for å dikte Anisotrop partikler, men tynn-film stretching er en enkel, allment akseptert metode som brukes til å generere en rekke ulike partikkel figurer14. Etter syntese, partikler er kastet i filmer og strukket i en eller to dimensjoner ved en temperatur over glass overgang temperaturen av partikkel. Filmen er da oppløst for å hente partikler. Til tross for økende interesse Anisotrop partikler, gjeldende metoder for fabrikere partikkel-baserte aAPC er stort sett begrenset til isotropic systemer og metoder for å endre partikkel formen kan være vanskelig å gjennomføre, kompatibel med visse aAPC syntese strategier og mangel presisjon og reproduserbarhet15. Våre tynn-film strekker teknikk kan utføres manuelt eller i et automatisert mote raskt generere Anisotrop partikler fra en rekke nedbrytbart polymerer, strukket til ønsket størrelsesforholdet i en eller to dimensjoner15.
Basert på våre tidligere arbeid, utviklet vi en biologisk nedbrytbart partikkel-basert tilnærming kombinert med skalerbare tynn-film strekk teknologi raskt generere aAPC med tunable størrelsen og formen på en standardisert måte for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo. Vår protein Bøyning strategi kan brukes å alle protein(s) rundt carboxyl grupper på partikkel overflaten på en ønsket tetthet, gir dette aAPC systemet en høy grad av fleksibilitet. Vi beskriver også metoder å karakterisere størrelse, morfologi og overflate proteininnhold på aAPC, og å vurdere deres funksjonalitet i vitro. Denne protokollen kan tilpasses enkelt å utvide immunceller ex vivo eller i vivo for en rekke immunterapeutisk programmer.
Denne protokollen detaljer en allsidig metode for presis generasjon av Anisotrop polymere partikler. Tynnfilm strekker teknikken beskrevet her er skalerbar, svært reproduserbare og billig. Alternative teknikker for å generere Anisotrop partikler lider mange begrensninger, inkludert høy pris, lav overføringshastighet og begrenset partikkelstørrelse. Tynnfilm strekker tilnærming er også en fordel fordi partiklene er endret slik at Anisotrop etter syntese, og resultatet er kompatibel med en rekke partikkelstørrelser…
The authors have nothing to disclose.
EBA (DGE-1746891) og KRR (DGE-1232825) Takk programmet NSF Graduate forskningsstipend for støtte. RAM Takk National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) og prestasjon belønningen for College forskere fellesskap støtte. Forfatterne takker NIH (R01EB016721 og R01CA195503), forskning for å hindre blindhet James og Carole gratis katalysator prisen, og JHU Bloomberg-Kimmel Institutt for kreft immunterapi for støtte.
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |