Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .
Abstract
Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) são uma plataforma promissora para modulação imune devido a sua potente capacidade de estimular células T. Substratos acelulares oferecem vantagens chaves sobre aAPC baseados em células, incluindo um controle preciso dos parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície aAPC modular suas interações com as células T. aAPC, construída a partir de partículas anisotrópicas, partículas particularmente elipsoidais, foram mostrados para ser mais eficaz do que suas contrapartes esféricos para estimulantes células T devido ao aumento de vinculação e maior área de superfície disponível para a célula T entrar em contato, bem como como reduzida absorção inespecífica e reforçadas propriedades farmacocinéticas. Apesar do aumento do interesse em partículas anisotrópicas, ainda amplamente aceita métodos de geração de partículas anisotrópicas tais como alongamento de filme fino pode ser um desafio para implementar e usar reproducibly.
Para este fim, descrevemos um protocolo para a preparação rápida, padronizada de biodegradável aAPC anisotrópica baseada em partículas com tamanho ajustável, forma e sinal de apresentação para células T expansão ex vivo ou na vivo, juntamente com métodos para caracterizar o seu tamanho, morfologia e superfície teor de proteínas e para avaliar sua funcionalidade. Essa abordagem para fabricar aAPC anisotrópica é escalável e reprodutíveis, tornando-a ideal para a geração de aAPC para imunoterapias “prateleira”.
Introduction
Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) têm mostrado promessa como agentes imunomoduladores porque elas podem gerar uma resposta robusta pilha de T antígeno-específicas. Essenciais para essas plataformas são sua capacidade de apresentar eficientemente cruciais sinais para a ativação de células T. AAPC acelular são uma alternativa atraente para aAPC baseados em células, porque eles são mais fácil e menos dispendiosa fabricar, enfrentam poucos desafios durante o scale-up e Tradução e atenuar os riscos associados com terapias baseadas em células. AAPC acelular também permitem um alto grau de controle sobre parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície que irá interagir com T células1.
aAPC deve recapitular um mínimo de dois sinais essenciais para a ativação de células T. Sinal 1 prevê o reconhecimento do antígeno e ocorre quando o receptor de células T (TCR) reconhece e se envolve com um MHC-classe I ou II, tendo seu antígeno cognato, culminando na sinalização através do TCR complexo. Para contornar a exigência de especificidade do antígeno, aAPC sistemas frequentemente suportar um agonístico anticorpo monoclonal contra o receptor CD3, que nonspecifically estimula o complexo TCR. Formas recombinantes do MHC, particularmente oriundas de MHC, também utilizámos na superfície da aAPC para fornecer o antígeno especificidade2,3. Sinal 2 é um sinal de co-estimulação que direciona a atividade das células T. Para fornecer o costimulation necessária para a ativação de células T, o receptor CD28 geralmente é estimulado com um anticorpo agonístico apresentado na superfície aAPC, apesar de outros receptores co-estimulação como 4-1BB foram alvejados com sucesso4. Proteínas de sinal 1 e 2 são normalmente imobilizadas na superfície de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Historicamente, aAPC têm sido fabricados a partir de uma variedade de materiais, incluindo poliestireno4,5 e ferro dextrano6. Sistemas mais novos utilizam polímeros biodegradáveis como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para gerar aAPC que pode ser facilmente acoplado para sinalizar proteínas, é adequados para a administração direta na vivoe pode facilitar a liberação sustentada de encapsulados de citocinas ou fatores solúveis para aumentar a ativação de célula T7,8.
Além da presença de proteínas de sinal necessário, engajamento do receptor sobre uma superfície suficientemente grande durante a interação de célula aAPC/T é essencial para a ativação de células T. Assim, os parâmetros físicos da aAPC como tamanho e forma drasticamente alteram sua área de contato disponível e afetam sua capacidade de estimular células T. AAPC micro-empresas foram mostrados para ser mais eficaz em estimular as células T do que suas contrapartes de nanoescala9,10. No entanto, nano-aAPC pode ter biodistribuição superior e melhor drenagem para os linfonodos que pode melhorar seu desempenho na vivo sobre micro-aAPC11. A forma é outra variável de interesse em sistemas baseados em partículas aAPC. AAPC anisotrópica recentemente foram mostrados para ser mais eficaz do que partículas isotrópicas a estimular as células T, principalmente devido à interação aprimorada com células alvo juntamente com absorção reduzida celular específico. Células ligam preferencialmente ao eixo longo de partículas elipsoidais, e o maior raio de curvatura e superfície mais plana que permitem mais contato entre a aAPC e células T12. O longo eixo das partículas elipsoidais também desencoraja a fagocitose, resultando em aumento da circulação de tempo em comparação com as partículas esféricas em vivo administração12,13a seguir. Devido a estas vantagens, partículas elipsoidais mediam a maior expansão do antígeno-específicas T células in vitro e em vivo em comparação com as partículas esféricas, um efeito observado em ambos os micro e nanoscales12, 13. Existem várias estratégias para fabricar partículas anisotrópicas, mas alongamento de película fina é um método simples, amplamente aceitado, usado para gerar uma gama de partículas diversas formas14. Após a síntese, partículas são lançadas filmes e esticadas em uma ou duas dimensões, a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do material das partículas. O filme é então dissolvido para recuperar as partículas. Apesar do crescente interesse em partículas anisotrópicas, abordagens atuais para fabricação baseada em partículas aAPC limitam-se principalmente aos sistemas isotrópicos, e métodos de alterar a forma das partículas podem ser difícil de implementar, incompatível com certa síntese aAPC estratégias e falta de precisão e reprodutibilidade15. Nossa técnica de alongamento de película fina pode ser executada manualmente ou em um modo automatizado para gerar rapidamente partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, esticada para uma proporção desejada em uma ou duas dimensões15.
Baseado no nosso trabalho anterior, desenvolvemos uma abordagem baseada em partículas biodegradável combinada com tecnologia de alongamento de thin-film escalável para gerar rapidamente aAPC com tamanho ajustável e a forma de uma forma padronizada para células T expansão ex vivo ou em vivo. Nossa estratégia de conjugação de proteínas pode ser usada para acoplar qualquer somáticas de interesse aos grupos da carboxila na superfície da partícula em uma densidade desejada, dando a este sistema de aAPC um alto grau de flexibilidade. Descrevemos também métodos para caracterizar o tamanho, morfologia e teor de aAPC de proteínas de superfície e para avaliar sua funcionalidade em vitro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para expandir as células imunes ex vivo ou na vivo para uma variedade de aplicações de imunoterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalha um método versátil para a geração precisa de partículas poliméricas anisotrópicas. A película fina alongamento técnica descrita aqui é escalável, altamente reprodutível e barato. Técnicas alternativas para a geração de partículas anisotrópicas sofrem muitas limitações, incluindo o alto custo, baixa taxa de transferência e tamanho de partícula limitada. A película fina, abordagem de alongamento também é vantajosa porque as partículas são modificadas para serem anisotrópica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (DGE-1746891) e o KRR (DGE-1232825) agradecem o programa de bolsa de pesquisa pós-graduação NSF para apoio. RAM graças a pesquisa nacional serviço prêmio NIH NCI F31 (F31CA214147) e as recompensas de realização para comunhão universitária de cientistas para apoio. Os autores agradecer o NIH (R01EB016721 e R01CA195503), a pesquisa para evitar cegueira James e Carole livre Catalyst Award e o Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de imunoterapia para apoio.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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