इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक कदम दर कदम गाइड करने के लिए 3 डी “जिगर पर एक चिप” हेपेटाइटिस बी वायरस के साथ संक्रमण प्रयोगों प्रदर्शन प्रदान करना है ।
vivo में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) के असाधारण infectivity के बावजूद, जहां केवल तीन वायरल जीनोम प्रयोगात्मक संक्रमित चिंपांजी की एक जीर्णता में परिणाम कर सकते हैं, इन विट्रो मॉडल में सेल प्रति वायरल जीनोम के हजारों के लिए कई सैकड़ों की आवश्यकता एक क्षणिक संक्रमण शुरू करने के लिए आदेश । इसके अतिरिक्त, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (PHH) के स्थैतिक 2d संस्कृतियों केवल अल्पकालिक उनके तेजी से भेदभाव के कारण पढ़ाई की अनुमति देते हैं । यहां, हम PHH के 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों का वर्णन, या तो monocultures में या अंय nonparenchymal जिगर के साथ cocultures में निवासी कोशिकाओं । ये शारीरिक मेजबान सेल प्रतिक्रियाओं के साथ दीर्घकालिक एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करते हैं । दवा प्रभावकारिता अध्ययन, विषाक्तता विश्लेषण, और रोगजनन में जांच को सुविधाजनक बनाने के अलावा, इन microfluidic कल्चर सिस्टम covalently बंद करने के उद्देश्य से एचबीवी संक्रमण के लिए उपचारात्मक उपचारों के मूल्यांकन को सक्षम, परिपत्र (सीसीसी) डीएनए । यह प्रस्तुत विधि PHH monocultures और PHH/Kupffer सेल सह संस्कृतियों, शुद्ध एचबीवी के साथ उनके संक्रमण, और मेजबान प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के सेट अप का वर्णन करता है । इस विधि एचबीवी संक्रमण, उपचार संयोजन, और रोगजनन के दीर्घकालिक प्रभावों के मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से लागू है ।
एचबीवी के अध्ययन के संस्कृति प्रणालियों के गरीब संवेदनशीलता से जटिल किया गया है, सेल प्रति एचबीवी जीनोम प्रतियां के हजारों के लिए कई सैकड़ों की आवश्यकता के लिए1संक्रमण शुरू करते हैं । इसके अलावा, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स आम तौर पर असाधारण नाजुक है और तेजी से पारंपरिक संस्कृतियों2के दौरान अंतर । यह मुख्य रूप से इस तथ्य के कारण है कि फ्लैट और हार्ड प्लास्टिक सतहों प्राकृतिक extracellular जिगर के भीतर पाया वातावरण की नकल नहीं है और microfluidic संचलन के अभाव में संस्कृतियों के ऑक्सीजन की सामांय कमी है । कोलेजन पर पारंपरिक स्थैतिक hepatocyte संस्कृतियों-लेपित प्लेटें तेजी से अंतर और एचबीवी3संक्रमण के लिए अपनी संवेदनशीलता खो देते हैं । यहां, हम का वर्णन सेट अप और 3 डी जिगर में हो PHH के संक्रमण पर एक चिप संस्कृतियों, जो काफी लाभप्रद है पर पारंपरिक 2d स्थैतिक PHH संस्कृतियों पर कोलेजन-लेपित उनके विस्तारित चयापचय और कार्यात्मक क्षमता के कारण प्लेटें, सुविधा की लंबी अवधि के संस्कृतियों में कम से ४० दिन4। इस प्रणाली में, PHH कोलेजन पर वरीयता प्राप्त कर रहे है लेपित पाड़, जो लगातार विकास के माध्यम से perfused है कोशिकाओं को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति । हालांकि murine fibroblasts या spheroids में 3d वृद्धि के जटिल cocultures के आधार पर PHH के लिए वैकल्पिक संस्कृति प्रणालियों को मांय किया गया है और एचबीवी के ५०० जीनोम समकक्षों (जीई) के संक्रमण की बहुलता का उपयोग कर संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है एचबीवी के प्रति सेल, 3d जिगर पर एक चिप संस्कृतियों इन विट्रो मॉडल प्रणाली4सेल प्रति एचबीवी के ०.०५ जीई के लिए अतिसंवेदनशील में एकमात्र रहते हैं । यह इसके अतिरिक्त dimethyl sulfoxide (DMSO) और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के उच्च सांद्रता का उपयोग कर इन संस्कृतियों में एचबीवी संक्रमण स्थापित करने की आवश्यकता से टिकी है, जो 3 डी जिगर के संक्रमण के लिए औषधालय है पर एक चिप संस्कृति प्रणाली 4. एचबीवी संक्रमण के प्रमुख बानगी के अलावा cccDNA पूल, जो सभी de नोवो के लिए transcriptional टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है–5virions उत्पादित,6. हालांकि cccDNA पारंपरिक hepatocyte संस्कृतियों में पता लगाया जा सकता है7,8, यह के रूप में स्पष्ट नहीं रहता है कि क्या cccDNA के विनियमन और किसी भी चिकित्सीय इसके उन्मूलन के उद्देश्य से दृष्टिकोण आंशिक रूप में recapitulated रहे है या पूरी तरह से विभेदित हेपैटोसाइट्स । हमें पता चला है कि cccDNA कार्यात्मक 3 डी जिगर में गठित है पर एक चिप संस्कृतियों, शारीरिक उत्तेजनाओं का जवाब है, और cccDNA जीनोम4transcriptional मशीनरी की पहुंच के साथ हस्तक्षेप द्वारा लक्षित किया जा सकता है ।
3 डी जिगर में एचबीवी संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाएं-पर-एक चिप एचबीवी संक्रमित रोगियों में मनाया उन नकल, संक्रमण के लिए, साथ ही चिकित्सकीय सफलता के लिए उपमार्कों की पहचान को सक्षम करने । जिगर पर एक चिप संस्कृतियों की अनूठी विशेषताओं के अलावा PHH और जिगर के भीतर अन्य nonparenchymal कोशिकाओं के बीच दीर्घकालिक मेजबान प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने की क्षमता है, सहित Kupffer कोशिकाओं4, तारामय कोशिकाओं9, और जिगर sinusoidal endothelial कक्ष10,11। यह एक जटिल 3d microenvironment में सेल/सेल इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है ।
इसके अतिरिक्त, इस मंच के विस्तारित संस्कृति अवधि अनुक्रमिक दवा उपचार और एचबीवी हठ है, जो पारंपरिक hepatocyte संस्कृति प्रणालियों का उपयोग संभव नहीं है पर उनके प्रभाव के मूल्यांकन की सुविधा ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों उत्पंन कर रहे हैं, या तो PHH के monocultures के लिए या Kupffer कोशिकाओं के साथ PHH के cocultures के लिए । इसके अलावा, हम कम की बहुलता के लिए शुद्ध एचबीवी के उत्पादन का वर्णन-संक्रमण अध्ययन, साथ ही साथ मेजबान और वायरल प्रतिक्रियाओं के बाद के विश्लेषण ।
PHH की दीर्घकालिक संस्कृतियों को बनाए रखने में चुनौतियों में वृद्धि की कार्यक्षमता और दीर्घायु, प्रत्येक प्रदर्शन अंतर लाभ और नुकसान के साथ कई संस्कृति मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया है । अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि PHH के स्थिर 2 डी संस्कृतियों समय की बहुत सीमित मात्रा के लिए hepatocyte जीव विज्ञान के कुछ पहलुओं नकल उतार रहे हैं । इस प्रकार, micropatterned cocultures12,13, अंडाकार आकृति संस्कृतियों14,15, और 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों16,17 तेजी से इन अधिक बुनियादी प्रणालियों की जगह ले रहे हैं । विशेष रूप से विशिष्ट microenvironments का उपयोग करने के लिए अपने मेजबान के साथ coevolved है जो संक्रामक रोगों का अध्ययन, जब, शारीरिक वातावरण प्रदान करने के लिए आवश्यकता संवर्धन मानव-रेखा के अक्सर चुनौतीपूर्ण प्रकृति द्वारा टिकी है हेपेटाइटिस सी वायरस, एचबीवी, और मलेरिया सहित संक्रामक रोगों ।
3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों प्रदर्शन में सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रारंभिक स्रोत प्राथमिक सेल प्रकार की गुणवत्ता है । इन कोशिकाओं को उनके पालन क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए और केवल प्लेटी PHH बहुत सफल ऊतक गठन और संस्कृति पीढ़ी को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हालांकि हौसले से अलग PHH इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके cryopreservation आमतौर पर जटिल है और विशेष दर नियंत्रित फ्रीजर की आवश्यकता है ।
पारंपरिक स्थैतिक 2d संस्कृतियों के विपरीत, मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि एचबीवी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता के संबंध में नगण्य है, और सभी इस प्रकार अब तक परीक्षण hepatocyte दाताओं एचबीवी संक्रमण4स्थापित करने में सक्षम हैं ।
हालांकि रोगी-व्युत्पंन एचबीवी 3 डी संस्कृतियों के संक्रमण स्थापित करता है, वायरल एचबीवी की पीढ़ी के लिए inducible inocula निर्माता सेल लाइनों का उपयोग करते हुए यह खूंटी-उपजी और सुक्रोज तकिया-शुद्ध एचबीवी का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । सेल संस्कृति supernatants सीधे 3 डी जिगर पर लागू-एक चिप संस्कृतियों, या तो निरोधात्मक कारकों की उपस्थिति या हेपैटोसाइट्स के साथ वर्तमान विकास कारकों की एक असंगति के कारण के माध्यम से, संक्रमण में आसानी से परिणाम नहीं है । इसके अतिरिक्त, जब रोगी-व्युत्पंन वायरल inocula का चयन, केवल सीरम इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के बाद से प्लाज्मा अनिवार्य रूप से coagulates और संस्कृति मंच के microfluidic संचलन को रोकना ।
वायरल इनोक्युलम के बावजूद इस्तेमाल किया, सेलुलर व्यवहार्यता और भेदभाव, के रूप में अच्छी तरह से प्रारंभिक एचबीवी इनोक्युलम के पूर्ण हटाने को सुनिश्चित करने के लिए आश्वस्त, सफल दीर्घकालिक संक्रमण अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे सुविधाजनक तरीका यह करने के लिए है नमूने वायरल इनोक्युलम को हटाने के बाद संस्कृतियों, साथ ही संस्कृति की अवधि में मानव सीरम एल्ब्युमिन स्तर को मापने । नोट की, इसी तरह सभी अंय वर्णित प्लेटफार्मों के लिए, एचबीवी संक्रमण, एक बार स्थापित, संक्रमित कोशिकाओं को आसानी से नहीं फैलता है । इस के लिए अंतर्निहित तंत्र vivo में एचबीवी संक्रमण के बाद से मायावी रहता है जिगर के भीतर हेपैटोसाइट्स के बहुमत को आसानी से संक्रमित ।
PHH और Kupffer कोशिकाओं के cocultures के संबंध में, यह IL6 उत्तेजना के जवाब में TNFα और एलपीएस स्राव का मूल्यांकन करने के लिए Kupffer कोशिकाओं के बहुत परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है, के बाद से नहीं सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Kupffer सेल दाताओं एक समान जवाबदेही है.
महत्वपूर्ण बात, सभी दवा उपचार या एचबीवी के साथ संस्कृतियों के प्रारंभिक संक्रमण के लिए, अच्छी तरह से (१.४ मिलीलीटर), साथ ही microfluidic चैनल (०.२ मिलीलीटर) की कुल मात्रा, दवा या इनोक्युलम सांद्रता की गणना के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए । आदेश में सही खुराक आश्वासन देने के लिए, एचबीवी या ड्रग्स युक्त माध्यम के साथ एक धुलाई कदम के क्रम में microfluidic चैनल प्रधानमंत्री के लिए किया जाता है ।
मंच इस्तेमाल किया ६००,००० PHH प्रति अच्छी तरह से उपयोग करता है, जो पाड़ों के भीतर multilayered हेपैटोसाइट्स सुनिश्चित करता है । हालांकि सेल संख्या अलग किया जा सकता है, चुना कोशिका एकाग्रता इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करता है । प्लेट प्रारूप में कुल 12 मचान धारण करते हैं, जिन्हें ३६ पाड़ों में अपग्रेड किया जा सकता है । हालांकि, microfluidic आवश्यकताओं के कारण, उच्च अच्छी संख्या तक स्केलिंग तिथि करने के लिए संभव नहीं है ।
इन तरीकों का उपयोग करना, संस्कृतियों को कम ४० दिनों के लिए इष्टतम सेल के प्रदर्शन के साथ बनाए रखा जा सकता है, जो, इस प्रकार अब तक, अभूतपूर्व उपंयास दवा उंमीदवारों का मूल्यांकन अवसर प्रदान करता है, साथ ही विभिंन यकृत कोशिका के बीच परिसर में खेल का अध्ययन एचबीवी संक्रमण के दौरान आबादी ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (६३७३०४), एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार (104771/जेड/14/जेड से एक स्टार्टर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया), और CN जैव नवाचारों द्वारा ।
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |