Анализ клеточного цикла в C. elegans микрофлорой с EdU аналог тимидина
Summary
Описан метод на основе изображений, может использоваться для определения S-фазе и анализировать динамику клеточного цикла в C. elegans Гермафродит микрофлорой, используя тимидина аналоговые EdU. Этот метод требует не трансгенов и совместим с immunofluorescent окрашивание.
Abstract
Анализ клеточного цикла в эукариот часто использует хромосома морфологии, выражения и/или локализации продуктов генов, необходимых для различных стадиях клеточного цикла, или включение Нуклеозидные аналоги. В S-фазе полимераз включают тимидина аналогов как EdU или BrdU в хромосомную ДНК, маркировка клетки для анализа. C. elegansнуклеозидов аналоговые EdU подается к червей в ходе регулярных культуры и совместим с immunofluorescent методами. Микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнализацию путей, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла, потому что это прозрачная, генетически снисходительный, и meiotic профаза и клеточной дифференциации/гаметогенеза происходят в Ассамблея как линейно. Эти особенности делают EdU большой инструмент для изучения динамических аспектов mitotically Велоспорт клеток и развития микрофлорой. Этот протокол описывает успешно подготовить EdU бактерий, кормить их к одичал тип C. elegans гермафродитки, вскрыть гонад Гермафродит, краситель для включения EdU в ДНК, пятно с антител для обнаружения различных клеточного цикла и развития маркеров, изображение гонад и проанализировать результаты. Протокол описывает изменения в метод и анализа для измерения S-фазе индекс, M-фаза индекс, G2 продолжительность, продолжительность цикла клетки, скорость meiotic вступления и скорость прогрессирования meiotic профаза. Этот метод может быть адаптирована для изучения цикла клетки или клетки истории в других тканях, этапы, генетических стола и физиологических условиях.
Introduction
В развития животных сотни, тысячи, миллионы, миллиарды или даже триллионы клеток подразделений обязаны сформировать взрослого организма. Клеточный цикл, набор событий, клеточном составе G1 (ГАП), S (синтез), G2 (ГАП), и M (митоз) определить ряд событий, которые выполняются каждое деление клеток. Клеточный цикл является динамичной и лучше всего ценится в режиме реального времени, которое может быть технически сложным. Методы, представленные в настоящем Протоколе позволяют сделать измерения этапов и сроков клеточного цикла из неподвижных изображений.
Маркировка с Нуклеозидные аналоги, такие как 5-ethynyl-2′-дезоксиуридина (EdU) или 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) является золотым стандартом для определения S-фазы в исследованиях динамики клеточного цикла в взрослого Caenorhabditis elegans (C. elegans) Гермафродит микрофлорой1,2,3,4,5. Эду и BrdU может использоваться в почти любой генетический фон, как они не полагаются на любом генетические конструкции. Визуализация BrdU требует суровых химической обработки подвергать антигена антитела анти BrdU окрашивание, которое часто является несовместимым с оценки других клеточных маркеров визуализированы пятнать совместно с дополнительные антитела. Напротив визуализации EdU происходит по химии нажмите мягкая условиях и таким образом совместим с антителом, совместно пятнать6,7.
Специфика метки ясно, поскольку ядер только учесть аналогов (5-ethynyl-2′-дезоксиуридина) тимидина ДНК в S-фазе. Визуализация занимает место в фиксированных тканей. EdU метка невидимым сама по себе вплоть до азид содержащих красителя или Флюорофор ковалентно реагирует с алкины в EdU медь катализируемого нажмите химия8. EdU маркировки может обеспечить немедленное информацию, на которой ядра находятся в S-фазе, с помощью короткого импульса маркировки. EdU может также обеспечить динамическую информацию, с помощью импульса Чейз или непрерывной маркировки; например в эксперименте пульс Чейз, метка разбавляется на каждое деление клеток или распространяются как nondividing клетки прогресс через развитие.
Гермафродит микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнальные пути, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла. Взрослый микрофлорой является поляризованной конвейера с помощью стволовых клеток найдены на дистальном конце следуют вход и прогрессии через meiotic профаза, координироваться с этапами гаметогенеза более проксимально (рис. 1). В проксимальном конце ооциты Зрелые, являются овуляция и оплодотворенной и начать эмбриогенеза в матку9,10,11. ~ 20 клеток диаметр длинные районе дистального наконечника ячейка, которая включает в себя mitotically Велоспорт стволовых микрофлорой, клетки-предшественники и meiotic клетки в S-фазе, но не для ячейки в meiotic профаза, называют прародителем зоны2,4 , 9 , 12. клеточные мембраны обеспечивают неполного разделения между ядрами в дистальной микрофлорой, но прародитель зоны клетки претерпевают митотическая клеток, Велоспорт в основном самостоятельно. Средний митотический клеточный цикл продолжительность микрофлорой клетки-предшественники зоны в молодых взрослых гермафродитки составляет ~6.5 ч; G1 фазе краткие или отсутствует, и покоя не наблюдается1,2,13. Микрофлорой дифференцировки стволовых клеток происходит через по существу прямым дифференциации и таким образом не хватает транзит усилительных дивизий4. Во время дифференциации в стадии pachytene примерно 4 из 5 ядер не образуют яйцеклеток, но вместо этого проходят apoptosis, действуя как медсестра клетки, жертвуя их цитоплазматических содержимое для развивающихся ооцитов12,14 , 15.
В дополнение к маркировке клетки в S-фазе с аналогами нуклеозидов можно определить клетки митоз и мейоз, используя Пятнать антитела. Ядер в митозе иммунореактивных к анти фосфо гистонов H3 (Ser10) антитела (так называемый pH3)7,16. Ядра в мейоз иммунореактивных антитела анти его-3 (белок оси meiotic хромосома)17. Ядер в зоне прародитель может быть идентифицирован отсутствие HIM-3, наличие nucleoplasmic REC-818или наличие WAPL-119. Интенсивность WAPL-1 является высоким в соматической гонад, высокий в зоне прародителю и низкой во время ранних meiotic prophases19. Несколько клеточного цикла измерения возможны несколько вариантов в протоколе: я) определить ядер в S-фазе и измерения индекс S-фазе; II) M-фаза идентификации ядер и измерения индекс М-фаза; III) определяет, были ли ядер митотическая или meiotic S-фазе; IV) измерить продолжительность G2; V) измерить течении G2 + M + G1 фаз; VI) измерить скорость meiotic въезда; VII) оцените meiotic прогрессии.
Можно сделать несколько клеточного цикла измерений от лишь нескольких видов мокрой лабораторных экспериментов. Протокол ниже описывает 30 мин пульс маркировки кормления C. elegans взрослых гермафродитки с EdU помечены бактерии и совместной маркировки M-фаза клетки путем пятнать с анти pH3 антитела и прогениторных клеток зоны путем пятнать антитела анти WAPL-1. Анализы (шаг 8.3) требуются для дополнительных измерений, и только изменения в продолжительности EdU корма (шаг 2.5), тип антител занятых (шаг 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка EdU меченых бактерий (шаг 1) имеет решающее значение для настоящего Протокола и первой точкой для устранения неполадок. Молодых взрослых гермафродитки одичал тип метки очень надежно в 4 h EdU пульс, что делает этот элемент полезным для каждого нового пакета EdU меченых бактерий. Кр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны E. coli фондовый центр для MG1693; Wormbase; Центр генетики Caenorhabditis , который финансируется за счет национальных институтов из здравоохранения управление исследовательской инфраструктуры программы (P40OD010440) для штаммов; Zach Pincus статистические консультации; Айпин Фэн реагентов; Люк Шнайдер, Андреа шарф, Sandeep Кумар и Джон Brenner для обучения, консультаций, поддержки и полезной дискуссии; и Корнфельд и Schedl лаборатории для обратной связи на этой рукописи. Эта работа частично поддержали национальные институты здравоохранения [R01 AG02656106A1 к KK, R01 GM100756 к TS] и Национальный научный фонд лектор стипендий [DGE-1143954 и DGE-1745038 с ЗК]. Национальные институты здравоохранения ни Национальный научный фонд имел какую-либо роль в конструкции изучения, сбора, анализа и интерпретации данных, ни в письменной форме рукописи.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
References
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. 발생학. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. 발생학. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. 유전학. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. 발생학. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
