Определение репродуктивного компетентности путем подтверждения наступления полового созревания и выполнение анализа фертильности у мышей и крыс
Summary
Многие процедуры и генетические мутации влияют сроки половой зрелости и плодородия. Этот протокол описывает неинвазивный метод для оценки начала полового созревания в мышей и крыс до создания исследование фертильности в половозрелых животных.
Abstract
Оценка компетентности репродуктивного имеет решающее значение для понимания воздействия лечения или генетические манипуляции на оси репродуктивного, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Репродуктивного ось является ключевым интегратор окружающей и внутренней ввода адаптации рождаемости благоприятные условия для размножения. Прежде чем приступать к исследование фертильности у мышей и крыс, половой зрелости оценивается исключить возможность того, что наблюдаемое репродуктивного фенотипов, вызванных задержкой или отсутствует пубертатном начала. Этот протокол описывает неинвазивная подход к оценке пубертатном начала в мужчины через определение препуция разделения и женщин через влагалище и первая течка. После подтверждения завершения полового созревания и достижения половой зрелости может быть начато исследование фертильности. Процедура описывает условия оптимального размножения для мышей и крыс, как настроить исследование фертильности и какие параметры, чтобы оценить и определить, если лечение или удаление ген влияет на фертильность.
Introduction
Для достижения половой зрелости и репродуктивного компетенции требуется переходного периода полового созревания. Пубертатном переходного периода и поддержания плодородия в зрелом возрасте регулируется репродуктивного оси, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси (рис. 1). Сроки наступления полового созревания и поддержания плодородия жестко регулируется как внутренних, так и экологических факторов, чтобы увеличить шансы на выживание потомства и родители1,2. Этот протокол обеспечивает неинвазивная подход для определения начала полового созревания в мышей и крыс для подтверждения половой зрелости до создания плодородия исследование для оценки репродуктивного компетенции.
Исследование фертильности проводится в половозрелых животных и может быть начато после животные прошли через полового созревания. До начала полового созревания оси репродуктивного покоя, и ключевым фактором полового созревания, гонадолиберин (GnRH), выпускается на гипофиза в недостаточной суммы для начала полового созревания (рис. 1). Наступления полового созревания — сложный процесс, который приводит к увеличению выпуска GnRH на средний возвышение. ГнРГ способствует лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза, два гормоны, гонадной созревания и репродуктивной функции (рис. 1)3,4,5 .
Оскорбления к оси репродуктивного приведет снижение фертильности и может также заранее или задержки начала полового созревания. Условия, знаны, что влияют на сроки начала полового и репродуктивного компетенции включают в себя воздействие на эндокринную, нарушая химических веществ6,7, увеличение/уменьшение тела вес1,8, изменения в 2,длина день9 и генетические мутации10,11,12,13,14,15.
Наступления половой зрелости является важным шагом, который необходимо выполнить до настройки анализа фертильности. Преимущества определения пубертатном начала через препуция разделения, влагалище и первой течки, являются неинвазивные характеристики этих процедур, как они не требуют сбора крови или жертвоприношения животных16, 17.
После начала полового созревания определяется, правильно исследование фертильности обеспечит важную информацию о целостности репродуктивного оси и обычно имеет второе преимущество создания экспериментальных животных для дальнейшего исследования (уточнение) 18. установки исследование фертильности, указанных в настоящем Протоколе может обнаруживать мелкие и крупные дефициты в репродуктивных компетенции у самцов и самок. Основные параметры оценки включают в себя 1) время первый помет, 2) количество пометов, сгенерирована заданного размера сроки и 3) помет. Наконец включены рекомендации для типа последующих исследований, которые могут проводиться для определения причины ухудшения плодородия.
Описывается протокол относится к мышей и репрезентативных данных отражают работу у трансгенных мышей. Однако все включенные протоколы одинаково допустимы в крыс.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общее самочувствие мышей имеет решающее значение для успешного плодородия пробирного21. При выполнении анализа фертильности, важно не физически проверить на мышей каждый день, как это может вызвать стресс. Далее Избегайте частых Кейдж изменения, как они также напряженный. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарю авторов первоначальной работы, которая является основой этого издания. Благодаря Aitor Aguirre, Женевьев э. Райан и Эрика л Schoeller за помощь в подготовке рукописи. Благодаря ли Джессика Сора и Остин Чин для оказания технической помощи с рукописью. H.M.H. была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала национальных институтов здоровья под награду номер R00HD084759.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. 발생학. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
