Este protocolo describe la extracción y purificación de células endoteliales de arteria pulmonar (PAECs) que se adhieren a las puntas del globo de catéteres de Swan-Ganz, mientras se acuñan en la arteria pulmonar durante el cateterismo cardíaco derecho y permanecer adherente a la globo desinflado después del retiro del cuerpo del paciente.
Una variedad de patologías conducen a hipertensión pulmonar (PH), que se define como una presión de arteria pulmonar media superior a 25 mmHg en reposo. Para diagnosticar y controlar el PH, los pacientes experimentan cateterizaciones repetidas de corazón derecho (RHC) en donde se avanza un catéter de Swan-Ganz en una rama de la arteria pulmonar y se infla un globo para la punta del catéter de la cuña. Este artículo ilustra un protocolo por el que las células endoteliales de arteria pulmonar (PAECs) pueden ser cosechadas de las puntas del globo de catéteres de Swan-Ganz después de RHC y purificadas con una técnica de columna anti-CD146 afinidad para purificar putativas PAECs. Estas células podrían utilizarse para proporcionar una instantánea in situ del estado biológico del endotelio de la vasculatura pulmonar para complementar las mediciones hemodinámicas obtenidas durante RHC. Cosecha y PAECs purificados se pueden utilizar para cualquier cultivo de células o para posteriores ensayos analíticos como flujo cytometery.
Las guías estadounidenses y europeas actuales requieren cateterismo cardíaco derecho para el diagnóstico de hipertensión pulmonar1. Los médicos y los científicos tratando de entender esta enfermedad desean de muestras biológicas de la vasculatura pulmonar para complementar los datos hemodinámicos que se reunieron en RHC. Desafortunadamente, el riesgo asociado con biopsia vascular pulmonar es muy alto, y por lo tanto las muestras biológicas de la vasculatura pulmonar son raramente si siempre Obtenido de pacientes vivos sometidos a RHC. Mientras que ha ganado mucho conocimiento de tejido vascular pulmonar obtenida de cadáver o pulmón explantado, estas muestras es incapaces de reflejar la biología el PH del proceso de enfermedad como se desenvuelve en un paciente vivo. En 2013, primero divulgado que las células endoteliales de arteria pulmonar (PAECs) son despojadas de las ramas de la arteria pulmonar por contacto físico con la punta del globo del catéter de Swan-Ganz durante RHC y pueden ser recuperadas en una pequeña cantidad de las puntas de catéter después el procedimiento2.
Este artículo ilustra nuestra técnica para la extracción y purificación de las células endoteliales de arteria pulmonar (PAECs) de las extremidades del globo de catéteres de Swan-Ganz tras cateterismo cardíaco derecho. Hasta ahora, la metodología para la realización de esta técnica de cosecha se ha descrito en detalle suficiente en la literatura para garantizar resultados homogéneos entre laboratorios realizar la técnica. Este artículo está pensado para superar esta deficiencia, que ofrece visualizar demostración de la técnica, de noche colección de puntas de catéter hasta el producto final de purificada CD146 + las células endoteliales. Esta técnica debe ayudar en el avance de la investigación en la Patobiología de diversas etiologías del PH y posiblemente resultar en el desarrollo de nuevos ensayos de diagnóstico para complementar datos hemodinámicos durante RHC.
La importancia de esta técnica en el campo de la investigación y medicina vascular pulmonar es que proporciona acceso a una instantánea de la biología del endotelio pulmonar en situ y en contraste con estudios anteriores en el pulmón explantado o cadavérico, no representa un punto final para el pulmón del sujeto. Recientemente, hemos demostrado que un biomarcador de anti-apoptosis en estas células puede tener utilidad en fenotipaje más precisamente relacionadas con variedades de hipertensión pulmonar3. El rendimiento de las células obtenidas es relativamente pequeño, ~ 5, 000-25.000 PAECs por muestra y estas células son difíciles (pero no imposible) a la cultura. Creemos que los investigadores y los clínicos inteligentes encontrará sinergias entre estas técnicas de compañero para avanzar en el pronóstico, diagnóstico y la investigación vascular pulmonar.
La técnica descrita en este artículo se aprecia mejor en el contexto de los anteriores paradigmas experimentales para estudiar el endotelio vascular pulmonar. Los intentos anteriores para obtener PAECs de los seres humanos se han limitado a los pulmones explantados cadavérico5 y una tentativa de breve duración para desarrollar un catéter de arteria pulmonar biopsia6. Como se señaló en un reciente informe7, la presente técnica se distingue de la cosecha de tejido pulmonar por su capacidad para obtener PAECs de una vida humana y hacerlo en varios puntos de tiempo en la progresión de la enfermedad o terapia. Sin embargo, debe señalarse que una técnica de compañero se ha divulgado recientemente por el inducido por células madre pluripotentes (IPSCs) puede ser transdifferentiated en PAECs4,5. Esta técnica produce abundantes cultivos de PAECs específico para cada paciente y permite el estudio de los efectos de fondo genético específico para cada paciente en biología PAEC. A pesar de estas ventajas, estas PAECs derivados de IPSC no pueden ofrecer cualquier información sobre la interacción entre el microentorno local y fondo genético específico para cada paciente. Nuestro grupo ha presentado la opinión de que la “punta del cateterismo” y técnicas IPSC están probables que en avanzar en el campo8.
Dentro de este contexto histórico y actual, cabe señalar las limitaciones de esta técnica. En primer lugar, es importante tener en cuenta que los rendimientos de PAECs derivados de este método pueden variar considerablemente. Presumiblemente, paciente-enfermedad específicas del estado y del médico factores contribuyen a esta variabilidad, como el Protocolo no contiene medidas que se espera que resulte en pérdida importante del material de fuente. La tabla 1 muestra a representante que cd146 + rendimientos de una variedad de cosechas PAEC utilizando puntas de catéter de una variedad de pacientes con Estados de enfermedad diferentes de la hipertensión pulmonar y una variedad de operadores de médico. En segundo lugar, los rendimientos de la célula son general baja, y su viabilidad para el cultivo ha demostrado para ser más bajo todavía en nuestras manos. Mientras que previamente hemos crecido culturas de PAECs utilizando este método1, asumen esos resultados representan rescate de un subconjunto de células madre tras la muerte de la mayoría de la muestra y sólo intermitentemente éxito en nuestras manos. Por ejemplo, no es infrecuente encontrar solamente algunos docena adherente PAECs en cultura por la mañana después de una cosecha ha sido plateada. A menudo estas micro-culturas no sobreviven a la expansión. Es necesario seguir trabajando para optimizar este protocolo de manera que la viabilidad de PAECs y sus condiciones en la cultura para lograr el objetivo deseado de propagación de las cosechas PAEC específico para cada paciente. Por último, la selección positiva CD146 que hemos adaptado no puede excluir la contaminación con otras CD146 + células, tales como circulación de4de las células endoteliales, pericitos, células musculares lisas y rara CD146 + T células9,10. Sin embargo, estas células se presume que son muy pocos en número en las muestras recogidas de esta manera, y CD146 es considerablemente más específico de este protocolo que otros marcadores de la célula de las células endoteliales como el CD31 (que también está presente en una variedad de transmisión sanguínea células como las plaquetas11). Las mejoras futuras encaminadas a mejorar la especificidad deben sopesarse frente a su efecto potencialmente negativo sobre el rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a los médicos y personal del servicio de insuficiencia cardíaca avanzada y la hipertensión pulmonar del Hospital General Allegheny de apoyo para la prestación de cientos de muestras de catéter durante varios años que han facilitado la optimización de esta metodología.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |