Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile
Summary
Descriviamo il protocollo dettagliato per la progettazione, la simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per un rack di fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie.
Abstract
Sistemi meccanici basati su nanostrutture di DNA o DNA nanomacchine, che producono movimento complessi su scala nanometrica in 2D e 3D in nanometro ångström risoluzione, mostrano il grande potenziale in vari campi della nanotecnologia come i reattori molecolare, consegna della droga, e sistemi di nanoplasmonic. Il rack di fisarmonica DNA riconfigurabile, che può manipolare collettivamente una rete su scala nanometrica 2D o 3D di elementi, in più fasi in risposta agli ingressi del DNA, è descritto. La piattaforma ha il potenziale per aumentare il numero di elementi che DNA nanomacchine controllabili da pochi elementi per una scala di rete con più fasi di riconfigurazione.
In questo protocollo, descriviamo l’intero processo sperimentale del rack fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie. Il protocollo comprende una procedura di simulazione e regola di progettazione delle strutture e un esperimento di bagnato-laboratorio per sintesi e riconfigurazione. Inoltre, analisi della struttura utilizzando TEM (microscopia elettronica di trasmissione) e FRET (trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza) sono incluso nel protocollo. I nuovi metodi di progettazione e simulazione coperti in questo protocollo aiuterà i ricercatori a utilizzare il rack di fisarmonica di DNA per ulteriori applicazioni.
Introduction
Sistemi meccanici basati su nanostrutture di DNA o DNA nanomacchine1,2,3,4,5 sono unici perché producono movimento complessi su scala nanometrica in 2D e 3D in nanometro a Ångström risoluzione, secondo vari biomolecolari stimoli2,3,6. Associare i materiali funzionali su queste strutture e controllando le loro posizioni, queste strutture possono essere applicate alle varie aree. Per esempio, DNA nanomacchine sono stati proposti per un reattore molecolare7, droga consegna8e nanoplasmonic sistemi9,10.
In precedenza, abbiamo introdotto il riconfigurabile rack fisarmonica del DNA, che può manipolare una rete su scala nanometrica 2D o 3D di elementi11 (Figura 1A). A differenza di altre DNA nanomacchine che controllano solo pochi elementi, la piattaforma può manipolare collettivamente periodicamente disposti elementi 2D o 3D in varie fasi. Prevediamo che una rete di reazione chimica e biologica programmabile o un sistema di calcolo molecolare può essere costruito dal nostro sistema, aumentando il numero di elementi controllabili. La cremagliera della fisarmonica di DNA è una struttura, in cui la rete di fasci multipli di DNA è collegata alle articolazioni composti di DNA single-stranded (Figura 1B). La cremagliera della fisarmonica generata dai fasci del DNA viene riconfigurata da blocchi di DNA, che ibridano a parte adesiva di travi e cambiare l’angolo tra le travi secondo la lunghezza della parte passerella delle serrature (stato bloccato). Inoltre, multi-step riconfigurazione è dimostrato aggiungendo nuove serrature dopo la formazione dello stato libero rimuovendo blocchi di DNA attraverso basati su toehold strand displacement12,13.
In questo protocollo, descriviamo l’intero processo di progettazione e sintesi di rack fisarmonica DNA riconfigurabile. Il protocollo comprende progettazione, simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per la sintesi del DNA della fisarmonica rack di 6 per 6 maglie e una riconfigurazione di questi. La struttura coperta nel protocollo è il modello base della precedente ricerca11 e 65 nm da 65 nm in dimensioni, composto da 14 fasci. In termini di progettazione e simulazione, la progettazione strutturale della cremagliera della fisarmonica è diversa da convenzionale del DNA origami14,15 (cioè, imballato strettamente). Pertanto, la regola di progettazione e simulazione molecolare sono stati modificati dai metodi tradizionali. Per illustrare, mostriamo la tecnica di progettazione utilizzando il metodo modificato di caDNAno14 e la simulazione del rack fisarmonica utilizzando oxDNA16,17 con script aggiuntivi. Infine, sono descritti entrambi i protocolli di TEM e FRET per l’analisi delle strutture configurato rack della fisarmonica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo introduce l’intero processo dalla progettazione, simulazione, sintesi e analisi della cremagliera della fisarmonica DNA 2D base. Le regole di simulazione e Progettazione modificata sono stati descritti perché la regola di progettazione è diverso da quello di origami di DNA standard, in quanto il rack di fisarmonica di DNA ha nucleotidi supplementari presso i crossover per flessibilità14,15. Da questo, ci aspettiamo che il protocollo può acce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta dal programma internazionale del centro di sviluppo ricerca attraverso National Research Foundation di Korea(NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) e Nano· Programma di sviluppo di tecnologia materiale attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610). L’Istituto di ricerca ingegneria all’Università nazionale di Seoul fornito di strutture di ricerca per questo lavoro. Autori riconoscono gratitudine verso Yoon Tae-Young (scienze biologiche, Università nazionale di Seul) per quanto riguarda la spettroscopia di fluorescenza per l’analisi FRET.
Materials
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
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