通过成人角质层可视化果蝇腿运动神经元轴突
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 通过固定, 安装, 成像和后成像步骤, 可视化的荧光灯蛋白在果蝇成人腿的轴突靶向。
Abstract
神经元规范的大部分工作都是在基因和生理上易于处理的模型 (如C) 中进行的。线虫,果蝇幼虫和鱼类, 它们都从事波动运动 (如爬行或游泳) 作为他们的主要运动模式。然而, 对单个运动神经元 (MN) 规范 (至少在告知疾病治疗方面) 的更复杂的理解要求一个同样易于驾驭的系统, 更好地模拟复杂的基于附属物的运动方案。脊椎动物。成人果蝇运动系统, 负责步行满足所有这些标准与轻松, 因为在这个模型中, 它是可能的研究一个小数目的容易分辨的腿 MNs (大约 50 MNs 每腿) 的规格都使用一个巨大的一系列强大的基因工具, 以及基于附属物的运动方案的生理环境。在这里, 我们描述一个协议, 以可视化腿部肌肉神经支配在成人苍蝇。
Introduction
像脊椎动物肢体,果蝇成人腿被组织成段。每只苍蝇腿包含14个肌肉, 其中每一个包括多个肌肉纤维1,2。成人腿 MNs 的细胞体位于 T1 (前胸), T2 (mesothoracic) 和 T3 (metathoracic) 神经节的两侧的腹神经线 (VNC), 结构类似于脊椎动物脊髓 (图 1)。有大约 50 MNs 在每个神经节, 目标肌肉在四段的同侧腿 (髋, 粗隆, 股骨和胫骨) (图 1)3。重要的是, 每一个成人腿 MN 有一个独特的形态特征, 是高度定型的动物之间3,4。所有这些独特的 MNs 来自11干细胞, 称为果蝇 (国家统计局) 生产腿部 MNs 在幼虫阶段3,4。在幼虫阶段结束时, 所有未成熟的分裂后 MNs 在蜕变过程中区分, 以获得其特定的树突状轴和突索末端目标, 它们定义了其独特的形态学3,4。以前, 我们测试了一个假设, 即转录因子组合编码 (TFs) 指定每个果蝇成人腿 MN5的独特形态。作为一个模型, 我们使用血统 B, 其中一个 11 NB 血统, 产生七的 MNs, 并证明了 TFs 的组合代码表示在分裂后成人腿 MNs 指示他们的个人形态。通过 reprograming MNs 的 TF 代码, 我们能够以可预测的方式切换锰形态。我们调用这些 tfs: mTFs (形态学 TFs)5。
成人 MNs 形态学分析的最具挑战性的部分之一是通过高分辨率的厚和自动荧光角质层可视化轴突。我们通常标签轴突与膜标签 GFP 表示在 MNs 与二进制表达系统, 如DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP或DVglut-QF/QUAS mCD8::GFP, 其中DVglut是一个强大的驱动程序表示在运动神经元6。通过将这些工具与其他克隆技术 (如镶嵌分析与阻遏标记 (MARCM)7、cis MARCM8或 MARCMbow5) 相结合, 我们可以将 GFP 表达限制为 MNs 的亚群进行表型分析轴突更容易。我们已经生成了一个协议, 以保持腿部锰轴突形态学完好的成像和随后的3D 重建通过解决成人果蝇腿固有的特定问题, 如 (1) 固定的成人腿的内部结构不影响轴突形态学、内源性荧光表达和腿部肌肉, (2) 腿的安装, 以保持盖玻片下的整体结构和适当的成像方向, 和 (3) 图像处理获得角质层背景以及轴突荧光信号。虽然该协议已被详细用于检测锰轴突的荧光表达, 但它可以应用于可视化节肢动物中腿部 neuromusculature 的其他成分。
Protocol
Representative Results
Discussion
成人果蝇的角质层和其他含有许多深色色素的节肢动物, 是观察其体内结构的主要障碍。此外, 它是强自动荧光, 这是由固定更糟。这两个特点是非常困难的观察荧光染料或分子体内的动物与外骨骼。
我们所描述的程序和我们在实验室中经常使用的过程会产生轴突轨迹的清晰和详细的图像, 以及它们在成年果蝇腿上的末端终点。重要的是, 没有从腿部角质层发出的荧光的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢罗伯特纳尔准备飞行食品培养基。这项工作得到了 NIH 补助金 NS070644 R.S.M. 的支持, 并由 ALS 协会 (#256)、FRM (#AJE20170537445) 和 ATIP 艾文莉项目资助 J.E。
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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