Visualisere Drosophila etappe Motor Neuron Axons gjennom voksen Cuticle
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere axonal målretting med et fluorescerende protein i voksen Ben Drosophila fiksering, montering, imaging og etter bildebehandling trinnene.
Abstract
Fleste arbeid på neuronal spesifikasjonen er utført i genetisk og fysiologisk medgjørlig modeller som C. elegans Drosophila larver og fisk, som alle deltar i undulatory bevegelser (som kravlesøk eller svømme) som sin primære modus for bevegelse. Men en mer sofistikert forståelse av personlige motoriske nervecellen (MN) spesifikasjonen-minst i informere sykdom behandling-krever en like tett system som bedre modeller for komplekse appendage-baserte bevegelse ordninger av virveldyr. Voksen Drosophila locomotor systemet for gangavstand oppfyller alle disse kriteriene med letthet, siden i denne modellen er det mulig å studere spesifikasjon av et lite antall enkelt å skille etappe MNs (ca 50 MNs per etappe) både med et stort matrise av kraftige genetisk verktøy, og i fysiologiske sammenheng av en appendage-baserte bevegelse. Her beskriver vi en protokoll for å visualisere etappe muskler gir i en voksen fly.
Introduction
Som virveldyr lem, er Drosophila voksen beinet organisert i segmenter. Hvert fly Ben inneholder 14 muskler, hver består av flere muskelfibre1,2. Cellen legemer voksen etappe MNs ligger i T1 (prothoracic), T2 (spirakelen) og T3 (metathoracic) Ganglion på hver side av ventrale (VNC), et strukturelt analoge til vertebrate ryggmargen (figur 1). Det er ca 50 MNs i hver Ganglion, hvilke mål muskler i fire segmenter av ipsilateral etappe (hofte, trochanter, femur og tibia) (figur 1)3. Betydelig, har personlige voksen etappe MN en unik morfologiske identitet som er svært stereotype mellom dyr3,4. Alle disse unike MNs er avledet fra 11 stamceller, kalt neuroblasts (NBs) produserer etappe MNs under larver stadier3,4. På slutten av larver stadier alle skille de umodne postmitotic MNs under metamorfose å anskaffe deres spesifikk dendrittiske arbors og axonal terminal mål som definerer deres unike morfologi3,4. Tidligere testet vi hypotesen at kombinasjon koden transkripsjonsfaktorer (TFs) angir unik morfologi av Drosophila voksen etappe MN5. Som modell brukte vi avstamning B, en av 11 NB linjen som produserer sju av MNs og viste at en kombinasjon kode TFs uttrykt i postmitotic voksen etappe MNs dikterer deres personlige morphologies. Av reprograming TF koden for MNs har vi kunnet slå MN morphologies på en forutsigbar måte. Vi kaller dette TFs: mTFs (morfologisk TFs)5.
En av de mest utfordrende delene av de morfologiske analysene av voksen MNs er å visualisere axons gjennom en tykk og auto-fluorescerende cuticle med høy oppløsning. Vi vanligvis merke axons med en membran-merket GFP som uttrykkes i MNs med en binær uttrykk, for eksempel DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, der DVglut er en sterk driver uttrykt i motoneurons6. Ved å kombinere disse verktøyene med andre klonal teknikker som mosaikk analyse med repressible markør (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, kan vi begrense det GFP uttrykket subpopulasjoner av MNs gjør fenotypiske analyse av axons enklere. Vi har generert en protokoll for å holde beinet MN axonal morfologi intakt for bildebehandling og påfølgende 3D rekonstruksjon av adressering problemer iboende til voksen Drosophila beinet som (1) fiksering av de interne strukturene i voksen beinet uten å påvirke axon morfologi, endogen fluorescerende uttrykk og Ben muskulaturen, (2) montering av benet til bevare den overordnede strukturen under en dekkglassvæske og i riktig retning for bildebehandling, og (3) bildebehandling for å få cuticle bakgrunn samt axonal fluorescerende signal. Mens denne protokollen er detaljert for påvisning av fluorescerende uttrykk i MN axons, kan den brukes for å se andre komponenter av Ben neuromusculature i leddyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuticle voksen Drosophila og andre leddyr, som inneholder mange mørke pigmenter, er en stor utfordring for visning av strukturer i kroppen sin. I tillegg er sterkt auto fluorescerende som er fremstilt verre av fiksering. Disse to funksjonene er svært problematisk for observasjoner av fluorescerende fargestoffer eller molekyler i kroppen av dyr med et ytre skjelett.
Prosedyren at vi har beskrevet og at vi rutinemessig bruk i lab gir ren og detaljerte bilder av axon baner og endingene terminal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Robert Renard for forbereder fly mat medium. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend NS070644 å R.S.M. og finansiering fra ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) og ATIP-Avenir programmet til J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
