Mundtlige Intubation af voksen zebrafisk: en Model for evaluering af tarmens optagelse af bioaktive stoffer
Summary
Protokollen beskriver intubere voksen zebrafisk med en biologiske; derefter dissekere og forberede flowcytometri, Konfokal mikroskopi og qPCR tarmen. Denne metode tillader administration af bioaktive stoffer til at overvåge tarmens optagelse og den lokale immun stimulus fremkaldt. Det er relevant for afprøvning intestinal dynamikken i mundtlig forebyggelse.
Abstract
De fleste patogener invaderer organismer gennem deres slimhinde. Dette gælder især i fisk som de konstant er udsat for en mikrobiel-rige vandmiljø. Udvikle effektive metoder til oral levering af immunostimulanter eller vacciner, som aktiverer immunsystemet mod smitsomme sygdomme, er ønskeligt. I udformningen af profylaktisk værktøjer, gode eksperimentelle modeller er nødvendige for at teste deres ydeevne. Her viser vi en metode til oral intubation af voksen zebrafisk og et sæt af procedurer til at dissekere og forberede tarmen til flowcytometri, Konfokal mikroskopi og kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) analyse. Med denne protokol, kan vi netop administrere mængder op til 50 µL til at fiske, vejer ca. 1 g enkelt og hurtigt, uden at skade dyrene. Denne metode gør det muligt for os at udforske direkte i vivo optagelsen af fluorescently mærket forbindelser i tarmslimhinden og immunmodulerende kapacitet af sådanne biologics på det lokale websted efter intubation. Ved at kombinere downstream metoder såsom flowcytometri, histologi, qPCR og konfokal mikroskopi af tarmens væv, kan vi forstå, hvordan immunostimulanter eller vacciner er i stand til at krydse de intestinale mucosale barrierer, passere gennem lamina propria, og nå muskel, have en virkning på tarmens slimhinde immunsystemet. Modellen kan bruges til at teste kandidat mundtlige forebyggelse og levering systemer eller den lokale virkning af enhver oralt administreret bioaktive foderblandinger.
Introduction
Målet med denne artikel er at beskrive i dybde en enkel metode til oral intubation af zebrafisk, sammen med nyttige tilhørende downstream procedurer. Mundtlige intubation ved hjælp af zebrafisk er blevet en praktisk model i studiet af infektionssygdom dynamics, oral vaccine/immunostimulant, stof/nanopartikel udbredelse og effekt og tarm mucosal immunitet. For eksempel er zebrafisk mundtlige intubation blevet brugt i studiet af Mycobacterium marinum og Mycobacterium peregrinum infektion1. Lovmo et al. også brugt med succes denne model til at levere nanopartikler og M. marinum til mave-tarmkanalen af voksen zebrafisk2. Derudover Chen et al. bruges zebrafisk mundtlige intubation til at vise, at narkotika indkapslet af nanopartikler, hvornår administreres via mave-tarmkanalen, blev transporteret på tværs af blod hjerne barrieren3. Disse forfattere udført intubation baseret på den gauvage metode beskrevet af Collymore et al. 4 med nogle ændringer. Imidlertid de ikke giver en meget detaljeret protokol beskriver proceduren mundtlig intubation. Vi præsenterer her, en metode til oral intubation af voksen zebrafisk bygning på Collymore et al. 4 vi yderligere omfatter forberedelse af tarmen til relevante downstream analyse ved flowcytometri, Konfokal mikroskopi og qPCR.
Tarmen og især dens slimhinde er den første linje i forsvaret mod infektion og den primære lokalitet af næringsstof optagelse5. Når epitelceller og antigen-præsenterer celler inden for mucosale barrierer opfatter faresignaler, udløses en umiddelbar medfødte immunrespons. Næste, den meget specifikke adaptive immunrespons er etableret af T- og B-lymfocytter6,7. Udvikling af mundtlig vaccines er en nuværende fokusområde i vaccinologi. Sådanne vacciner vil være et effektivt redskab til at beskytte organismen på udsatte steder på grund af den specifikke svar af immunceller i slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT)8,9. I akvakultur har slimhinde vacciner åbenlyse fordele i forhold til injicerbare vacciner. De er praktiske for massevaccination, mindre arbejdskrævende, er mindre stressende til fisk, og kan gives til unge fisk. Ikke desto mindre skal slimhinde vaccine kandidater nå den anden gut segment uden at blive denatureret i den mundtlige miljø. De skal også krydser mucosale barrierer for at få adgang til antigen præsentere celler (PMV’er) til at fremkalde lokale og/eller systemisk svar10. Dermed, afprøvning af slimhinde optagelsen opnået af kandidatlande mundtlige antigener og deres fremføringsmidler, samt immun reaktion fremkaldt, er afgørende i udviklingen af orale vacciner.
I forbindelse med biomedicinske, udvikle en model for at teste biologiske virkninger af forbindelser efter mundtlig intubation er af stigende interesse. Mange af de anatomiske og fysiologiske funktioner for tarmen er bevaret mellem bilaterian slægter, med pattedyr og knoklede fisk11. Denne mundtlige intubation model tilsluttet downstream analyse kan være et redskab til at give indsigt i menneskets biologi, såvel som et testområde for biologiske lægemidler eller andre forbindelser i vivo.
Den mundtlige intubation protokol kan udføres af én operatør, fxkorrekt administration af op til 50 µL af protein nanopartikel suspension til fisk vejer 1 g, med en høj overlevelsesrate. Proceduren er enkel at sætte op og hurtig; 30 fisk kan være intubated i 1 h. Protokol for tarmen forberedelse er nøglen til at levere kvalitet celle og væv prøver til efterfølgende analyse. Der gives eksempler af downstream resultater som viser den protokol nytte i at opnå data relateret til tarmens optagelse og isolere kvalitet RNA for qPCR. Protokollen ville være til stor gavn for dem, der har behov for en passende model til at teste dynamikken i mundtlig forebyggelse eller andre forbindelser i tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er en forbedring af den tidligere beskrevne teknik til mundtlige intubation af Collymore et al. 4 vores protokol beskriver i detaljer den mundtlige intubation metode og omfatter udarbejdelse af tarmen for downstream analyser. Vores metode forbedrer fisk manipulation hastighed giver mulighed for en person til at udføre den hele protokol hurtigt, uden megen variation mellem operatører. Et væsentligste forskel i vores protokol med de foregående er at vi evaluere succesen m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det spanske ministerium for videnskab, Europa-Kommissionen og AGAUR midler til NN (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER og 2014SGR-345 AGAUR). RT afholder et PhD legat fra AGAUR (Spanien), JJ blev støttet af et ph.d.-stipendium fra Kina stipendium Rådet (Kina) og NN er understøttet af Ramón y Cajal-programmet (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi takker Dr. Torrealba for ekspertrådgivning i protein produktion, N. Barba fra “Servei de Microscopia” og Dr. M. Costa fra “Servei de Citometria” af Universitat Autònoma de Barcelona for nyttige tekniske bistand.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. 생물학. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
