Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese
Summary
En protokol til udredning af plante tylakoid protein kompleks organisation og sammensætning med blå indfødte polyacrylamid gel elektroforese (BN-side) og 2D-SDS-PAGE er beskrevet. Protokollen er optimeret til Arabidopsis thaliana, , men kan bruges til andre plantearter med mindre ændringer.
Abstract
Fotosyntetiserende elektron overførsel kæde (osv) omdanner solenergi til kemisk energi i form af NADPH og ATP. Fire store proteinkomplekser indlejret i tylakoid membran høst solenergi til at køre elektroner fra vand til NADP+ via to bannersystem, og brug den oprettede proton graduering for produktion af ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med særskilt orientering og dynamik i tylakoid membran. Værdifulde oplysninger om sammensætning og interaktioner af proteinkomplekser i tylakoid membran kan fås ved solubilizing komplekser fra membran integriteten af milde rengøringsmidler efterfulgt af indfødte gel elektroforese adskillelse af de komplekser. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en analytisk metode anvendes til adskillelse af proteinkomplekser i deres native og funktionelle form. Metoden kan bruges til protein kompleks rensning for mere detaljerede strukturel analyse, men det giver også et værktøj til at dissekere de dynamiske interaktioner mellem proteinkomplekser. Metoden har blev udviklet til analyse af mitokondriel respiratorisk proteinkomplekser, men siden blevet optimeret og forbedret for dissektion af tylakoid proteinkomplekser. Her give vi en detaljeret up-to-date protokol for analyse af labile fotosyntetiske proteinkomplekser og deres vekselvirkninger i Arabidopsis thaliana.
Introduction
Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produktionen af NADPH og ATP i fotosyntetiske lys reaktioner. I højere plante grønkorn ligger komplekser i tylakoid membran, der er et strukturelt heterogen membran struktur, bestående af appressed grana og ikke-appressed stroma tylakoiderne. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en flittigt brugt metoden i analysen af store multisubunit proteinkomplekser i deres native og biologisk aktive form. Metoden blev etableret for dissektion af mitokondrielle membran protein komplekser1, men er senere blevet tilpasset til adskillelsen mellem proteinkomplekser tylakoid membran netværk3. Metoden er egnet (i) til rensning af individuelle tylakoid proteinkomplekser for strukturel analyse, (ii) til bestemmelse af indfødte interaktioner mellem proteinkomplekser og (iii) til analyse af overordnede organisation af proteinkomplekser efter skiftende miljø stikord.
Før adskillelse er proteinkomplekser isoleret fra membran med nøje udvalgte nonionisk rengøringsmidler, som er generelt milde og bevare den oprindelige struktur af proteinkomplekser. Vaskemidler indeholder hydrofobe og hydrofile websteder og form stabile micelles over en vis koncentration, kaldet en kritisk micellar koncentration (CMC). Øger vaskemiddel koncentrationen over CMC resultaterne i afbrydelse af lipid-lipid interaktioner og i oploesning af proteinkomplekser. Valget af vaskemiddel afhænger af stabiliteten af protein kompleks af interesse og oploesning kapacitet af vaskemiddel. Rutinemæssigt anvendes rengøringsmidler omfatter α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Efter oploesning af proteinkomplekser i deres hjemstat uopløselige materiale fjernes ved centrifugering. I højere planter, tylakoid membran er meget heterogenic i struktur og nogle vaskemidler (f.eks. digitonin) solubilize selektivt kun en bestemt brøkdel af membran3. For at karakterisere protein kompleks organisation eller interaktioner mellem proteinkomplekser, er det derfor afgørende at altid bestemme oploesning kapacitet af den valgte vaskemiddel ved bestemmelse af indhold af klorofyl og klorofyl a/b forholdet mellem supernatanten at vurdere udbyttet og repræsenterede tylakoid (sub) domæne, henholdsvis i den solubilized brøk. Klorofyl a/b-forhold i intakt tylakoiderne vækst-lys akklimatiseret planter er typisk omkring 3, mens chl en / b værdi af tylakoid fraktioner beriget enten i grana eller stroma tylakoiderne falder under (~ 2,5) eller overstiger (~ 4,5) værdien af samlet Tylakoider, henholdsvis.
For at give negativ ladning til proteinkomplekser, tilføjes Coomassie strålende blå (CBB) farvestof solubilized prøven. På grund af Skift afgift proteinkomplekser vandrer mod anoden og er adskilt på en acrylamid (AA) gradient ifølge deres molekylmasse og form. Effektiv og høj opløsning adskillelse er opnået ved hjælp af en lineær acrylamid koncentration gradient. Under elektroforese overflytte proteinkomplekser mod anoden, indtil de når deres størrelse-afhængige pore-størrelse grænse. Porestørrelse polyacrylamid gel afhænger af (i) den samlede acrylamid /bis– acrylamid koncentration (T) og (ii) på tværs linker bis– acrylamid monomer koncentration (C) i forhold til den samlede monomerer4. Efter separation med BN-side, kan proteinkomplekser yderligere opdeles i deres individuelle protein-underenheder af anden-dimension (2D) – SDS – PAGE. Her beskriver vi en detaljeret protokol til analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotosyntetiserende energi konvertering maskiner er sammensat af store multisubunit proteinkomplekser, som er indlejret i tylakoid membran. Denne protokol beskriver en grundlæggende metode til analyse af planten tylakoid proteinkomplekser fra Arabidopsis thaliana med BN-side kombineret med 2D-SDS-PAGE. Protokollen er også velegnet til analyse af tylakoid proteinkomplekser fra tobak og spinat tylakoiderne, men kan kræve mindre justeringer.
Til oploesning af membran proteinkomplekser,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev økonomisk støttet af Finlands Akademi (projektnumre 307335 og 303757) og solenergi i biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie tilskudsaftalen (675006). Protokollen er baseret på reference3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
