ब्लू देशी जेल ट्रो द्वारा Thylakoid झिल्ली प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण
Summary
संयंत्र thylakoid प्रोटीन जटिल संगठन और ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पेज) और 2d-एसडीएस-पृष्ठ के साथ संरचना के elucidation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । प्रोटोकॉल Arabidopsis थालियानाके लिए अनुकूलित है, लेकिन छोटे संशोधनों के साथ अंय प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
संश्लेषक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण श्रृंखला (आदि) NADPH और एटीपी के रूप में रासायनिक ऊर्जा के लिए सौर ऊर्जा धर्मांतरित । चार बड़े प्रोटीन परिसरों thylakoid झिल्ली फसल सौर ऊर्जा में एंबेडेड के लिए पानी से इलेक्ट्रॉनों ड्राइव करने के लिए NADP+ दो photosystems के माध्यम से, और एटीपी के उत्पादन के लिए बनाया प्रोटॉन ढाल का उपयोग करें । Photosystem PSII, साई, cytochrome बी6एफ (Cyt बी6एफ) और ATPase multiprotein झिल्ली में अलग अभिविंयास और गतिशीलता के साथ सभी thylakoid परिसरों हैं । संरचना और thylakoid झिल्ली में प्रोटीन परिसरों की बातचीत के बारे में बहुमूल्य जानकारी के देशी जेल electrophoretic जुदाई के बाद हल्के डिटर्जेंट द्वारा झिल्ली अखंडता से परिसरों solubilizing द्वारा प्राप्त किया जा सकता परिसरों. ब्लू देशी polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पृष्ठ) एक विश्लेषणात्मक उनके मूल और कार्यात्मक रूप में प्रोटीन परिसरों की जुदाई के लिए इस्तेमाल किया विधि है । विधि प्रोटीन जटिल शोधन के लिए और अधिक विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्रोटीन परिसरों के बीच गतिशील बातचीत काटना करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है । विधि mitochondrial श्वसन प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था, लेकिन बाद से अनुकूलित और thylakoid प्रोटीन परिसरों के विच्छेदन के लिए सुधार किया गया है । यहां, हम labile संश्लेषक प्रोटीन परिसरों और Arabidopsis थालियानामें उनकी बातचीत के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत अप-टू-डेट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Introduction
बड़े multisubunit प्रोटीन परिसरों photosystem PSI और PSII, Cyt बी6एफ और ATPase NADPH प्रकाश प्रतिक्रियाओं में संश्लेषक और एटीपी के उत्पादन में समंवय । उच्च संयंत्र chloroplasts में, परिसरों thylakoid झिल्ली में स्थित हैं, जो एक संरचनात्मक रूप से विषम झिल्ली संरचना, appressed grana और गैर appressed स्ट्रोमा thylakoids शामिल है । ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-PAGE) अपने देशी और जैविक रूप से सक्रिय रूप में बड़े multisubunit प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के विश्लेषण में एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया विधि है । विधि mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसरों के विच्छेदन के लिए स्थापित किया गया था1, लेकिन बाद में thylakoid झिल्ली नेटवर्क3से प्रोटीन परिसरों की जुदाई के लिए अनुकूलित किया गया है । विधि उपयुक्त है (मैं) संरचनात्मक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत thylakoid प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए, (द्वितीय) प्रोटीन परिसरों और (iii) प्रोटीन परिसरों के समग्र संगठन के विश्लेषण के लिए के बीच देशी बातचीत का निर्धारण करने के लिए पर्यावरण cues बदलने पर ।
जुदाई से पहले, प्रोटीन परिसरों सावधानी से चुना ईओण डिटर्जेंट, जो आम तौर पर हल्के और प्रोटीन परिसरों की मूल संरचना की रक्षा कर रहे है के साथ झिल्ली से अलग कर रहे हैं । डिटर्जेंट hydrophobic और हाइड्रोफिलिक साइटों और एक निश्चित एकाग्रता के ऊपर फार्म स्थिर micelles होते हैं, एक महत्वपूर्ण micellar एकाग्रता (सीएमसी) कहा जाता है । लिपिड के विघटन में सीएमसी परिणामों के ऊपर डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि-लिपिड बातचीत और प्रोटीन परिसरों के solubilization में. डिटर्जेंट का चुनाव ब्याज की प्रोटीन परिसर की स्थिरता और डिटर्जेंट की solubilization क्षमता पर निर्भर करता है । नियमित रूप से इस्तेमाल किया डिटर्जेंट α/β-dodecyl-maltoside और digitonin शामिल हैं । उनके पैतृक राज्य में प्रोटीन परिसरों के solubilization के बाद, अघुलनशील सामग्री केंद्रापसारक द्वारा निकाल दिया जाता है । उच्च संयंत्रों में, thylakoid झिल्ली संरचना में अत्यधिक heterogenic है और कुछ डिटर्जेंट (जैसे, digitonin) चुनिंदा solubilize केवल झिल्ली3के एक विशिष्ट अंश । इसलिए, प्रोटीन जटिल संगठन या प्रोटीन परिसरों के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए, यह हमेशा क्लोरोफिल सामग्री का निर्धारण करके चुना डिटर्जेंट की solubilization क्षमता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है और क्लोरोफिल a/ supernatant का अनुपात उपज और प्रतिनिधित्व thylakoid (उप) डोमेन, क्रमशः solubilized अंश का आकलन करने के लिए । क्लोरोफिल एक/विकास के बरकरार thylakoids में बी अनुपात-प्रकाश आदत संयंत्रों आम तौर पर 3 के आसपास है, जबकि chl thylakoid अंश का एक/बी मूल्य या तो grana या स्ट्रोमा thylakoids में नीचे गिर जाता है (~ २.५) या जादा (~ ४.५) कुल का मूल्य thylakoids, क्रमशः ।
प्रोटीन कॉंप्लेक्स के लिए नकारात्मक प्रभारी प्रदान करने के लिए, Coomassie प्रतिभाशाली नीले (CBB) डाई solubilized नमूना करने के लिए जोड़ा गया है । प्रभारी पाली के कारण, प्रोटीन परिसरों anode की ओर पलायन और एक acrylamide (एए) ढाल पर अपने आणविक द्रव्यमान और आकार के अनुसार अलग कर रहे हैं । प्रभावी और उच्च संकल्प जुदाई एक रैखिक acrylamide एकाग्रता ढाल का उपयोग करके हासिल की है । ट्रो के दौरान, प्रोटीन परिसरों anode की ओर पलायन जब तक वे अपने आकार निर्भर ताकना आकार सीमा तक पहुंचने । polyacrylamide जेल का ताकना-आकार पर निर्भर करता है (i) कुल acrylamide/बीआईएस-acrylamide एकाग्रता (टी) और (ii) क्रॉस-linker बीआईएसपर-acrylamide मोनोमर एकाग्रता (C) सापेक्ष कुल मोनोमर4. बीएन-पृष्ठ के साथ जुदाई के बाद, प्रोटीन परिसरों आगे दूसरे आयाम (2d) द्वारा अपने व्यक्तिगत प्रोटीन उपइकाईयों में विभाजित किया जा सकता है-एसडीएस-पृष्ठ । यहां, हम बीएन द्वारा thylakoid झिल्ली प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-पृष्ठ/2d-एसडीएस-पृष्ठ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संश्लेषक ऊर्जा रूपांतरण मशीनरी बड़े multisubunit प्रोटीन परिसरों से बना है, जो thylakoid झिल्ली में एंबेडेड हैं । इस प्रोटोकॉल बीएन के साथ Arabidopsis थालियाना से संयंत्र thylakoid प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए एक बुनि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान आर्थिक रूप से फिनलैंड की अकादमी (परियोजना संख्या ३०७३३५ और ३०३७५७) और बायोमास (SE2B) Marie Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते (६७५००६) में सौर ऊर्जा द्वारा समर्थित था । प्रोटोकॉल संदर्भ3पर आधारित है ।
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
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