Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese
Summary
En protokoll for utviklingen av anlegget thylakoid protein kompleks organisasjonen og komposisjon med blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) og 2D-SDS-side er beskrevet. Protokollen er optimalisert for Arabidopsis thaliana, , men kan brukes for andre plantearter med mindre modifikasjoner.
Abstract
Fotosynteseaktiviteten elektronet transport kjeden (ETC) konverterer solenergi til kjemisk energi i form av NADPH og ATP. Fire store protein komplekser innebygd i thylakoid membran høste solenergi kjøre elektroner fra vann til NADP+ via to photosystems, og bruke opprettet proton gradient for produksjon av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med forskjellig retning og dynamikk i thylakoid membranen. Verdifull informasjon om sammensetningen og interaksjoner av protein komplekser i thylakoid membranen kan fås ved solubilizing komplekser fra membranen integriteten av milde vaskemidler etterfulgt av innfødte gel electrophoretic separasjon av den komplekser. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en analytisk metode brukes for separasjon av protein komplekser i sin innfødt og funksjonell form. Metoden kan brukes for protein kompleks rensing for mer strukturelle analysen, men det gir også et verktøy for å analysere dynamisk samspillet mellom protein komplekser. Metoden har ble utviklet for analyse av mitokondrie åndedretts protein komplekser, men siden blitt optimalisert og forbedret for Disseksjon av thylakoid protein komplekser. Her gir vi en detaljert oppdatert protokoll for analyse av labilt fotosynteseaktiviteten protein komplekser og samhandlingen mellom Arabidopsisthaliana.
Introduction
Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produksjon av NADPH og ATP i fotosynteseaktiviteten lys reaksjoner. I høyere anlegget chloroplasts ligger komplekser i thylakoid membran, som er et strukturelt heterogene membran struktur, bestående av appressed grana og ikke-appressed stroma thylakoids. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en mye brukt i analysen av store multisubunit protein komplekser i sin innfødt og biologisk aktive form. Metoden ble etablert for Disseksjon av mitokondrie membran protein komplekser1, men har senere blitt tilpasset for separasjon av protein komplekser fra thylakoid membran nettverk3. Metoden er egnet (i) for rensing av personlige thylakoid protein komplekser for strukturell analyse, (ii) for å bestemme innfødt interaksjoner mellom protein komplekser og (iii) for analyse av organisasjonen av protein komplekser ved endring miljømessige signaler.
Før separasjon er protein komplekser isolert fra membranen med nøye utvalgte ikke-ionisert vaskemidler, som er vanligvis milde og beholde den opprinnelige strukturen av protein komplekser. Vaskemidler inneholder hydrofobe hydrofile områder og skjemaet stabil micelles over en viss konsentrasjon, kalt en kritisk micellar konsentrasjon (CMC). Økende vaskemiddel konsentrasjonen over CMC resultatene i avbrudd av lipid-lipid interaksjoner og solubilization av protein komplekser. Valg av vaskemiddel avhenger stabiliteten av protein kompleks av interesse og solubilization kapasitet vaskemiddel. Rutinemessig brukes vaskemidler inkluderer α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Etter solubilization av protein komplekser i sin opprinnelige tilstand fjernes uløselig materiale med sentrifugering. I høyere planter, thylakoid membranen er svært heterogenic i struktur og legger (f.eks digitonin) solubilize selektivt bare en bestemt del av membran3. Derfor betegner protein kompleks organisasjonen eller samspillet mellom protein komplekser, er det avgjørende å alltid bestemme solubilization kapasiteten til den valgte vaskemiddel ved å bestemme hva klorofyll og klorofyll a/b forholdet mellom nedbryting å vurdere avkastning og representert thylakoid (sub) domene, henholdsvis i solubilized brøken. Klorofyll a/b i intakt thylakoids vekst lys acclimated planter er vanligvis rundt 3, mens chl en / b-verdien av thylakoid fraksjoner beriket i grana eller stroma thylakoids faller under (~ 2,5) eller overskrider (~ 4.5) verdien av totalt thylakoids, henholdsvis.
For å gi negativ ladning til protein komplekser, er Coomassie briljant blå (CBB) fargestoff lagt til solubilized prøven. Følge av kostnad forskyvning, protein komplekser migrere mot anoden og skilles på en akrylamid (AA) gradert etter deres molekylær masse og form. Effektiv og høy oppløsning separasjon er oppnådd ved hjelp av en lineær akrylamid konsentrasjon gradient. Under geleelektroforese migrere protein komplekser mot anoden til de når deres størrelse-avhengige pore-størrelse grense. Pore-størrelse av polyakrylamid gel avhenger av (i) den totale akrylamid /bis– akrylamid konsentrasjon (T) og (ii) på kryss-linker bis– akrylamid monomer konsentrasjonen (C) i forhold til den totale monomerer4. Etter separasjonen BN side, kan protein komplekser videre deles inn i deres personlige protein underenheter andre dimensjon (2D) – SDS – side. Her beskriver vi en detaljert protokoll for analyse av thylakoid membran protein komplekser av BN-side/2D-SDS-side.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotosynteseaktiviteten energi konvertering maskiner består av store multisubunit protein kompleksene, som er innebygd i thylakoid membranen. Denne protokollen beskriver en grunnleggende metode for analyse av anlegget thylakoid protein komplekser fra Arabidopsis thaliana med BN side kombinert med 2D-SDS-side. Protokollen er også egnet for analyse av thylakoid protein komplekser fra tobakk og spinat thylakoids, men kan kreve små justeringer.
For solubilization av membran protein komp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble økonomisk støttet av Academy i Finland (prosjektnumre 307335 og 303757) og solenergi biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie grant avtale (675006). Protokollen er basert på referanse3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
