第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録
Summary
このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。
Abstract
現在利用可能な殺虫剤の大半は神経系をターゲットし、無脊椎動物神経蛋白質の遺伝の突然変異はしばしば有害な結果は、まだ個々 の神経系の活動を記録するための現在の方法をもたらす動物は高価で手間のかかるです。この吸引ショウジョウバエ、 3 齢幼虫中枢神経系の電極作製は多様な神経の生理学的役割を決定する生理エージェントの生理効果をテストするため扱いやすいシステム神経機能の遺伝的変異の影響と同様、中枢神経系活動への経路。この前のヴィヴォ準備では、唯一の適度なスキルと電気生理学的専門知識を解剖昆虫の神経活動を再現可能な記録を生成する必要があります。さまざまなペプチドを含む化学物質の変調器は、中枢神経系活動に及ぼす影響を測定するための生理食塩水による溶液中の神経システムに直接適用できます。GAL4/UAS システムなど、さらに、遺伝の技術は、単独に又は特定のイオン チャネルやトランスポーター、節足動物の中枢神経系機能に受容体の役割を決定する薬理学的エージェントと並行に適用できます。このコンテキストの記載法、毒物殺虫剤、昆虫生理学者、キイロショウジョウバエ確立されたモデル有機体の発達生物学者に重要な関心です。このプロトコルの目的は科学の多様性をテストするために有用であるショウジョウバエ、モデル昆虫の中枢神経系の電気発生の測定を有効にする電気生理学的手法、します。仮説。
Introduction
このアプローチの全体的な目標は、キイロショウジョウバエモデル昆虫の中枢神経系 (CNS) のハクスリーをすばやく計測する研究者を有効にするのには。このメソッドは、信頼性の高い、迅速、かつコスト効率的生理学的及び毒性学的実験.を実行するには中枢神経系は、適切な神経機能は理解または神経機能を変更するために広範囲にわたって検討されている生活とそのため、重要な生理学的な細道のために不可欠です。節足動物の中枢神経系内の信号経路の特性評価は、オフのターゲットの結果を制限しながら死亡を誘発する無脊椎動物の神経機能を混乱させる殺虫剤の化学の授業をいくつかの検出を可能にしました。したがって、昆虫の神経活動を測定する能力は昆虫毒物学および生理学の分野に大きな関心神経システムは配置された殺虫剤1の大多数のターゲット組織なので。昆虫の神経系に関する基礎・応用知識の成長可能性に限られているので現在の技術は労働集約的、高い費用を必要とする高度な神経生理学的手法が必要ですまだ、続けて昆虫神経細胞が限られているおよび/またはほとんどの節足動物の中央のシナプスへのアクセス制限があります。現在、ほとんどの昆虫神経蛋白の性状解析は昆虫内部整流器のカリウム チャネル2 について説明されたように、クローンとクローンの表現されたその後創と電気生理学的記録をで目標を必要とします。、昆虫のリアノジン受容体3、蚊電圧敏感な K+チャンネル4、および他の人。異種発現の要件や低機能発現の可能性を軽減するには、・ ブルームクイストと同僚の神経表現型を誘発することを目的と培養ハスモンヨトウ frugiperda (Sf21) 細胞の手法として殺虫剤検出5,6。これらのメソッドは新しい化学の開発のための有効なアプローチを提供まだ彼らはしばしば薬剤、殺虫剤抵抗性と評価の仕組み特定の特性のための乗り越えられないボトルネックを作成根本的な生理学的な原則。ここでは、可鍛遺伝学7,8,9があるモデル虫から電気的活動の記録及び神経の正常発現パターンができる前のヴィヴォ手法について述べる錯体10、11,12神経、新しく開発された薬の作用のモードや他の毒性学的研究のレベルでの抵抗機構の評価を有効にします。
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、昆虫の神経系または殺虫剤の作用機構を定義するための一般的なモデル有機体し、14 毒性13、薬理学的研究の最適モデル有機体として確立しています。 ,15、16神経生理学的および病態生理学的17,18,19,20脊椎動物のプロセス。D.melanogasterは、生殖の大人の段階に達する前に幼虫と蛹の段階を含む、完全な変貌を実行大人形昆虫です。発達過程を通して神経系が異なるライフ ステージで大幅な改造を受けるが、幼虫の中枢神経系は、この方法論の焦点になります。完全に開発された幼虫中枢神経系は解剖学的胸部および腹部のセグメントが融合し、繰り返されるとほぼ同じ neuromeric ユニット21,22の配列を表す腹側神経節を形成すると簡単です。運動神経を降順蚕食大脳核の尾側に属します、体壁の筋肉と幼虫の内臓器官を支配するのに至ります。図 1では、幼虫のショウジョウバエ中枢神経系の解剖について説明します。
ショウジョウバエ血液脳関門 (BBB) は、胚発生の終わりに開発し、subperineurial グリア細胞 (SPG)21によって形成されます。SPG 細胞全体のショウジョウバエ中枢神経系23をカバーする連続した、非常に平らな、内皮のようなシートを確立する広がる多数の糸状のようなプロセスを形成します。ショウジョウバエBBB が CNS21に栄養素や薬物動態のエントリを制御することにより神経の微小環境の恒常性を維持を含む脊椎動物の BBB との類似点です。BBB によって中枢神経系の保護を制限可能性を紹介その他薬物動態24,25ほとんどペプチド合成麻薬の浸透はまだ、これは信頼性の高い神経伝達と機能のための前提条件小分子のポーテンシーを特性評価する際の問題。メソッドは、この障壁を混乱させると中央のシナプスへの薬理学的アクセスを提供する単純な断裂を使用します。
説明の方法論の最大の強みは、シンプルさ、再現性、および比較的高スループット容量このシステムに固有のものです。プロトコルは比較的簡単にマスター、セットアップは小さなスペースを必要とし、初期金融入力だけは必要な検査試薬や消耗を抑えるは。さらに、この方法はイエバエ、イエバエ26.の中央の降順の神経活動を記録する完全に除去
Protocol
Representative Results
Discussion
詳細については関連のビデオで解説し、本文アクティビティとスパイクを記録するために重要なステップは放電前のヴィヴォショウジョウバエ中枢神経系の周波数を提供しています。短いまたは数降順ニューロン発火率レプリケートの大きな差異に起因するベースラインが減りますので、郭清の有効性はメソッドの最も重要な側面です。ただし、一度解剖技術を習得すると、こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
郭清とショウジョウバエの図に示す中枢神経系の画像陳瑞さんに感謝したいと思います。
Materials
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
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